 |
Выделение чистой культуры микробов(механические и биологические)
|
|
|
|
Чистая культура — это популяция микроорганизмов одного вида. Для выделения чистой культуры аэробов используют методы, основанные на:
ü Механическом разобщении бактериальных клеток
o Метод Дригальского - распределение капли суспензии материала с
ü помощью шпателя;
o Рассев штрихом;
o Метод Коха является количественным и позволяет определить
ü количество бактерий в исследуемом материале
ü Биологические методы:
o Посев на элективные среды;
o Метод Шукевича - посев материала в конденсат скошенного МПА для
ü выделения чистых культур бактерий, обладающих ползучим ростом
ü (например, протей);
o Обработка кислотами и щелочами (например, микобактерии
ü туберкулеза);
o Прогревание при 80°С для выделения споровых форм;
o Заражение лабораторных животных - для диагностики зоонозов и др.
ü (туляремия).
Выделение чистой культуры микробов является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.
Метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды. Очень широко применяются элективные питательные среды.
При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологический метод выделения чистой культуры применяется при исследовании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза. Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясо-пептонногоагара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43— 45 °С. В пробирку вносят одну бактериальную петлю исследуемого материала. После этого прокаленной и остуженной; петлей содержимое 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.
|
|
|
Метод дригальского
Метод Дригальского основан на механическом разобщении на поверхности плотной, питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуемого материала.
I этап.
1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовление
мазка* окраска по Граму). v
2. Посев на чашку Петри: одну каплю материала наносят на поверхность
МПА и растирают шпателем. Не обжигая шпателя и не набирая нового
материала, засевают вторую и третью чашки.
3. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате
18-20 часов при температуре 37°С.
II этап.
1. Макроскопическое изучение колоний по величине, форме, окраске,
характеру поверхности, краев, консистенции..
2. Микроскопическое изучение одной исследуемой колонии (приготовление
мазка, окраска по Граму).
3. Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирку со скошенным агаром.
4. Пробирку инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37°С.
III этап.
Проверка культуры на чистоту (макроскопическим - однородный рост, микроскопическим — однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признаками клетки).
|
|
|
IV этап.
Идентификация проводится по:
- ферментативным свойствам.
- антигенным свойствам, токсигенности и другим признакам
- фагочувствительности
Методы культивирования анаэробов(создание анаэробных условий)
Сущность условий, необходимых для культивирования анаэробов, заключается в снижении парциального давления молекулярного кислорода.
Механические методы:
1. Посев уколом в столбик сахарногоагара.
2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° Сагар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов — анаэробов.
3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиологическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Содержимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают анаэробы.
Физические методы:
1. Анаэростат — создание вакуумных условий.
2. Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).
3. Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,
Химические методы
1. Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пирогаллол.
2. Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета -сернистое железо.
|
|
|
