Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Векторы на основе вируса простого герпеса.




Для того чтобы ретро- и аденовирусные векторы инфицировали специфические типы клеток, нужно модифицировать их с помощью генной инженерии, однако, ВПГ I типа уже обладает сродством к определенному типу клеток. Он инфицирует нейроны и персистирует в них. Существует множество заболеваний, поражающих центральную и периферическую нервную систему: опухоли, метаболические и иммунные нарушения, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона). Вследствие тропности ВПГ к нервным клеткам он является подходящим вектором для генной терапии таких заболеваний. Доклинические испытания на экспериментальных животных показали, что гены, доставленные с помощью ВПГ-векторов в клетки мозга и периферической нервной системы, экспрессируются и поддерживаются длительное время. Однако до начала I фазы клинических испытаний ВПГ-векторов необходимо провести дополнительные исследования.

Невирусные способы доставки.

К преимуществам невирусных систем относятся отсутствие ограничений на размер генной конструкции, значительно меньшая по сравнению с вирусами иммуногенность. Помимо этого невирусные, особенно синтетические носители являются легко модифицируемыми системами, что облегчает процесс внесенияизменений в структуру комплексов и таким образом упрощает процесс их совершенствования.

К невирусным способам доставки относят:

· прямая инъекция

· рецепторо-опосредованный эндоцитоз

· генное ружье

· липофекция

· электропорация

· полимерные носители

Методы физической доставки генетических конструкций.

Наиболее известными методами физической доставки ДНК в клетки организма являются метод баллистической трансфекции ("генное ружье"), безигольное введение (needle-free injection), электропорация, и метод микроиъекций плазмидной ДНК. Принцип метода баллистической трансфекции заключается в том, что золотые микрочастицы с осажденной на них ДНК направляются к клеткам под действием сжатого газа при выстреле из специального устройства ("генного ружья"). При этом микрочастицы, пробивая клеточную мембрану, доставляют экзогенную ДНК в цитоплазму.

Безигольное введение предполагает использование в качестве доставки способа доставки плазмидной ДНК, осажденной на золотых частицах, потока физиологического раствора под высоким давлением. Указанные методы широко применяются для трансфекции клеток кожи и мышц для проведения "генной вакцинации".

Метод электропорации in vivo основан на локальном изменении электрического потенциала клеточной мембраны и возникновении пор после кратковременного воздействия серии разрядов электрического тока. Благодаря чему повышается уровень проникновения плазмидной ДНК в клетку и, соответственно, уровень экспрессии трансгена. Данный метод успешно применяется для лечения опухолей и трансфекции мышечных клеток. Привлекает своей простотой, доступностью, возможностями точной дозировки энергии электрического импульса.

Принцип метода микроинъекций заключается во введении чужеродной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку и является одним из наиболее часто используемых методов получения трансгенных животных. Однако, применение микроинъекий для генетической трансфекции многоклеточного организма не представляется возможным.

Недостатками существующих физических методов трансфекции являются невысокая эффективность и локальность эффекта доставки ДНК.

Генная терапия соматических клеток и половых клеток Доставка генных конструкций с использованием липосом.Данный метод подразумевает заключение ДНК внутрь липидного пузырька, который должен слиться с мембраной трансфецируемой клетки и таким образом обеспечить доставку конструкции в клетку. В экспериментах, проведенных Cristiano с соавторами, липосомы обеспечивали высокий уровень экспрессии маркерного гена в эндотелии легких мышей после введения суспензии комплексов в хвостовуювену, а также в эпителиальных клетках дыхательных путей после интраназального введения. Позже было показано, что липосомный метод трансфекции может являться перспективным для генной терапии муковисцидоза и бронхиальной астмы. Несмотря на то, что липосомы не обеспечивали такую эффективность проникновения ДНК в клетку, какая достигалась при использовании вирусных носителей, они были гораздо менее токсичны и иммуногены. Эта проблема была решена в 90-х годах двадцатого века созданием катионных липидов состоящих из положительно заряженной гидрофильной группы, связанной с липофильным остатком жирной кислоты. Основным недостатком новой конструкции считается нестабильность процесса формирования комплексов и их гетерогенность. По данным WenChi и соавторов, только одна из 1000 липосом обеспечивает экспрессию трансгена, тогда как эффективность вирусных носителей оказывается на порядок выше. Двухстадийное образование комплексов, включающее первичную компактизацию ДНК катионными пептидами и последующее присоединение липидного компонента, позволяет увеличить стабильность катионных липосом.

Доставка генных конструкций с использованием катионных полимеров.

Наиболее изученным катионным полимером является полиэтиленимин (ПЭИ). Существует несколько препаратов ПЭИ отличающихся по массе и разветвленности молекулы. Наиболее часто используют: разветвленные – 25-кДа ПЭИ (Aldrich) и 800-кДа ПЭИ (Fluka), линейный 22 кДа ПЭИ ExGen 500 (Euromedex).

ПЭИ способен связывать большие молекулы ДНК с образованием гомогенных комплексов размером до 100 нм, обеспечивать более эффективную защиту ДНК от нуклеазной деградации, чем другие поликатионы, благодаря высокой плотности заряда на поверхности молекулы и более плотной упаковки ДНК. При нейтральной рН только треть аминогрупп молекулы протонирована, и таким образом ПЭИ обладает значительной буферной емкостью. При кислых значениях рН при попадании комплекса ПЭИ/ДНК в эндосому, происходит протонирование большей части аминогрупп молекулы ПЭИ. Эффект "протонной губки" приводит к разрушению эндосом из-за осмотического шока, выходу комплексов в цитоплазму. Таким образом, протонирование аминогрупп ПЭИ предотвращает деградацию ДНК, происходящую при слиянии эндосом с лизосомами. Эндоосмотические свойства ПЭИ обеспечивают высокий уровень трансфекции in vitro, сравнимый с использованием вирусных векторов. Но из-за высокой токсичности, причиной которой является высокая плотность положительных зарядов, ПЭИ не применяется широко in vivo/

Одним из примеров поликатионных пептидных носителей ДНК конструкций является полилизин. Он был одним из первых полимеров, использованных для невирусной доставки ДНК в организм. Преимуществом аминокислотных носителей является биодеградируемость, что особенно актуально для доставки ДНК in vivo. Модификация полилизина остатками жирных кислот значительно увеличивает эффективность трансфекции iv vitro по сравнению с катионными липосомами.

В последнее время активно исследуются сополимеры полилизина, наиболее перспективными из которых считаются сополимеры лизина и гистидина, а также полилизин, модифицированный остатками имидазола.

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...