Методика проведения работы

ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Методические указания к лабораторным работам

по дисциплине «Экология микроорганизмов» для студентов направления 020200.62 «Биология» профиль «Микробиология» и специальности

020209.65 «Микробиология»

 

Мурманск, 2010

 

 

УДК 579:502.211 (076.5)

ББК 28.4+28.080-5я7

Э 40

 

Составитель:

Литвинова Марина Юрьевна – старший преподаватель кафедры микробиологии;

 

Методические указания рассмотрены и одобрены кафедрой микробиологии МГТУ, протокол № 1 от 16 сентября 2010 г.

 

 

Рецензент -

Перетрухина А.Т. – зав.кафедрой кафедры микробиологии, профессор, доктор биологических наук

 

Оглавление

 

	Введение
	Лабораторная работа №1 Углеводородокисляющие микроорганизмы, как естественная часть гетеротрофного бактериопланктона водных экосистем
	Лабораторная работа №2 Эвтрофные и олиготрофные бактерии, как основные группы гетеротрофного бактериопланктона
	Лабораторная работа №3 Оценка качества воды
	Лабораторная работа №4 Микроорганизмы, обитающие в ризосфере и ризоплане растений
	Лабораторная работа №5 Эпифитные микроорганизмы зерна
	Лабораторная работа №6 Окисление жира микроорганизмами
	Лабораторная работа №7 Разложение белковых веществ микроорганизмами
	Лабораторная работа №8 Анаэробное разложение клетчатки микроорганизмами
	Лабораторная работа №9 Денитрификация
	Лабораторная работа №10 Изучение свободноживущих азотфиксирующих бактерий
	Список использованной литературы
	Приложение 1. Таблица Мак-Креди

 

 

Введение

Одним из направлений современной микробиологии является экология микроорганизмов. В настоящее время эта наука бурно развивается, используя новые методы микроэлектродной техни­ки для изучения микроокружения экологических ниш микробов, точные методы химического анализа с применением техники вы­сокоэффективной жидкостной хроматографии, газовой хроматографии и масс-спектроскопии, методы молеку­лярной биологии в манипулировании и анализе экстрактов нук­леиновых кислот (ДНК и РНК) из природных образцов, позво­ляющих с высокой избирательностью исследовать состав микроб­ных сообществ на молекулярном уровне. Не теряют актуальности методы анализа микроорганизмов в отношении состава жирных кислот, клеточной стенки, отдельных липидов.

Исследователи, занимающиеся проблемами экологии микроорганизмов, доказали, что среда обитания последних охватывает весьма широкие зоны биосферы, часто с экстремальными усло­виями обитания, где не могут развиваться ни растения, ни жи­вотные. Микроорганизмы найдены в самых глубоких слоях океа­на, где рядом с подводными термальными источниками они фор­мируют новые оазисы жизни, не основанной на первичной фототрофной продукции органического вещества, а полностью зави­сящей от образования органического вещества в результате дея­тельности хемолитотрофных микроорганизмов. В толще скальных пород на глубинах 4 - 6 км микроорганизмы осуществляют «водородный» и «метановый» циклы. Наконец, микроорганизмы обна­ружены высоко в горах, вплоть до высоты 8 км, а также внутри метеоритных остатков.

Термин «эко­логия микроорганизмов» («микробная экология») стали широко использовать в 60-х годах XX в., экологически ориентированные работы с микроорганизмами проводили уже давно. Еще Левен­гук обнаружил микроорганизмы в каплях дождевой воды (их ес­тественное местообитание) и выявил действие перца на микро­бы (влияние окружающей среды). В конце XIX - начале XX вв. С.Н. Виноградский и М.Бейеринк разработали принципы элек­тивных культур, что можно определить как дату рождения науки, которую впоследствии стали называть «экология микроор­ганизмов». С. Н. Виноградскому принадлежит идея использовать градиенты света, сульфида и кислорода (знаменитая «колонка Виноградского») для изучения природных популяций сульфидокисляющих фотоавтотрофных бактерий, сульфатвосстанавливающих и хемоавтотрофных сульфид- и сероокисляющих бакте­рий, одновременно присутствующих в одном местообитании и осуществляющих взаимозависимые процессы.

Экология микро­организмов является наукой, которая специальным образом изу­чает взаимоотношения между микроорганизмами и их биотичес­ким или абиотическим окружением.

Последующее развитие микробиологии было связано с посто­янным выделением микроорганизмов из их природных местообита­ний, определением метаболитического потенциала и изучением их роли в биогеохимических циклах азота и серы. Микроорганизмы стали находить в каждой пробе воды, почвы, воздуха, у животных и растений. Микроорганизмы продемонстрировали огромное раз­нообразие форм и мест заселений, включая экстремальные по температурам, давлению, солености и рН. Тот факт, что в пробах, взятых в природе, почти никогда не находят микроор­ганизмов в виде чистых культур, позволил сделать вывод о взаи­модействии микробных популяций друг с другом и микроокруже­нием, с его быстро изменяющимися физико-химическими пара­метрами.

Лабораторная работа №1

Углеводородокисляющие микроорганизмы, как естественная часть гетеротрофного бактериопланктона водных экосистем

Цель работы: определить количественный и качественный состав углеводородокисляющих микроорганизмов в воде морских (и/или пресных) водоёмов.

Большинство живых организмов в принципе способно к окислению углеводородов, что связано с наличием у них ферментов оксидаз. Функ­ции последних состоят в окислении кислородом воздуха восстановлен­ных соединений, образующихся в клетке, таких как НАДН, НАДФ и другие. Эти ферменты и осуществляемые ими реакции представляют собой участки дыхательной цепи, функционирующей в аэробных орга­низмах. Оксидазы могут распространять свое действие и на окисление СН₃-, СН₂- и СН-групп углеводородов. Поэтому незначительные ко­личества алифатических или ароматических углеводородов, попавшие в организм животных или человека, окисляются имеющимися в тканях оксидазами и выводятся. Однако основной вклад в процессы биохимического разрушения нефти вносят микроорганизмы, способные использовать углеводороды в качестве единственного источника угле­рода и энергии. Такие формы встречаются, в основном, среди аэробных микроорганизмов. Они получили название углеводородокисляющих. От других гетеротрофных микроорганизмов, многие из которых способны окислять углеводороды побочно, в небольших количествах и только в присутствии других органических соединений, углеводородокисляющие отличаются наличием не только комплекса ферментов, окисляющих углеводороды, но и системы поглощения гидрофобного субстрата. В первую очередь это связано с тем, что окисление углеводо­родов происходит внутриклеточно.

К окислению углеводородов способны как эвтрофные, так и олиготрофные бактерии, выделяемые из воды на обычных питательных средах, не содержащих углеводородов. Численность углеводородокисляющих бактерий в различных акваториях определяется теми же факторами среды, что и обычных гетеротрофных бактерий в целом — это климат (температура), наличие биогенных элементов, доступных источников углерода и другие факторы. Преимущество над остальными группами бактерий углеводородокисляющие получают при существенном загряз­нении среды углеводородами. Нефтяное загрязнение вносит дополнительный источник углерода в экосистему и численность углеводородокисляющих бактерий возрастает до тех пор, пока другие факторы не становятся лимитирующими. По этой причине численность углеводородокисляющих бактерий всегда выше в хронически загрязненных угле­водородами водах, чем в свободных от загрязнения районах.

Изучение численности углеводородокисляющих микроорганизмов является неотъемлемой задачей при исследовании деструкции нефти в водоеме или определении способности акватории к естественному самоочищению. Результаты определения численности углеводородокисляющих микроорганизмов зависят от используемых для этого методов.

К углеводородокисляющим бактериям относятся бактерии из родов Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Cytophaga, Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Methanobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Pseudomonas, Vibrio, мицелиальные грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Fusarium, Trichoderma, дрожжи - Candida, Endomyces, Rhodotorula, Saccharomyces, Torulopsis.

Задание:

- нарисовать схему посева для количественного определения углеводородокисляющих микроорганизмов;

- определить количество углеводородокисляющих микроорганизмов в 1 мл морской и/или пресной воде;

- выделить чистые культуры углеводородокисляющих микроорганизмов;

Материалы и оборудование: солиNaCl, MgSО₄x7Н₂О, КС1, К₂НРО₄, Na₂HPО₄, NH₄NО₃, K₂HPO₄, FeSO₄, (NH₄)₂SO₄, CaCO₃, агар, пробирки, стерильные градуированные пипетки на 1 мл; пинцеты, стерильные шпатели, микроскопы и все необходимое для приготовления окрашенных пре­паратов и микроскопирования.

Методика проведения работы:

1. Определение численности углеводородокисляющих микроорганизмов

Для учета углеводородокисляющих бактерий ис­пользуют среду ММС с дизельным топливом (г): NaCl - 7,0; MgSО₄x7Н₂О - 1,0; КС1 - 0,7; К₂НРО₄ - 2,0; Na₂HPО₄ - 3,0; NH₄NО₃ - 1,0; вода дистиллированная - 1,0 л. В качестве единственного источника углерода и энергии в среду для учета углеводородокисляющих бактерий добавляют дизельное топливо (летнее), а Источник углерода и энергии до­бавляют в количестве двух капель на пробирку с предварительно при­готовленными разведениями пробы воды. Предварительно дизтопливо или смесь ароматических соединений стерилизуют а автоклаве. Соленость среды при необходимости может быть понижена за счет уменьшения содержания в среде NaCl. Эту же среду можно использовать для учета углеводородокисляющих бактерий в пресных водоемах, исключив из ее состава NaCl.

Метод предельных разведений: Наиболее распространенным методом учета численностибактерий, способных к росту на питательных средах, является метод предельных разведений, который иногда называют методом наиболее вероятного чис­ле. Приготовленную жидкую питательную среду ММС с дизельным топливом разливают в пробирки с заранее подобранными ватными пробками по 9 мл в каждую. Среда обязательно должна быть прозрачной, если она мутная, то перед разливом в пробирки ее фильтруют. После разлива пробирки стерилизуют в автоклаве.

Непосредственно перед началом работы пробирки со средой устанавливают в штатив в 3 ряда (по числу повторностей), при этом в каждом ряду может быть от 3 до 6 пробирок. На пробирках надписывают номер разведения (крупная цифра) и справа снизу - индекс повторности (1₁, 1₂,...1₆ для первого ряда; 2_1; 2₂,...2₆ для второго ряда и 3_1; 3₂...3₆для третьего ряда).

Для приготовления разведений 1 мл пробы воды отбирают сте­рильной пипеткой из склянки с пробой воды, переносят в пробирку с 9 мл среды, имеющую индекс 1. За­тем этой же пипеткой отбирают из склянки следующие 1 мл пробы воды и переносят в пробирку со средой, имеющую индекс 2. Затем эту операцию повторяют для пробирки с индексом 3. Таким образом получают первое разведение пробы воды - 1:10.

Затем берут другую стерильную пипетку и с ее помощью тщатель­но перемешивают содержимое пробирки 1 набирая в нее содержимое пробирки и выпуская обратно и пробулькивая в пробирку из пипетки воздух. Это делается потому, что бактерии из первой взятой порции пробы воды адсорбируются на стенках пипетки, что может привести к недоучету их численности. Эту операцию повторяют не менее двух раз. Далее этой же пипеткой отбирают из пробирки 1 - 1 мл первого разведения пробы и переносят в пробирку с индексом 1. Таким образом, получают второе разведение - 1:100. Эти же манипуляции той же пипеткой повторяют с пробирками 2₁ и 3₁.Из них переносят уже разведенные в 10 раз пробы воды в пробирки с индексами 2₂ и 3₂ соответственно. Так же готовят и все последующие разведения, используя для приготовления каждого из них новую стерильную пипетку.

Время инкубации проб воды зависит от состава среды и исходной численности микроорганизмов в пробе воды. Как правило, для углеводородокисляющих бактерий может достигать 1 месяца и более. Пробирки с разведениями инкубируют при комнатной температуре, желательно не выше 20⁰С. В зимний период желательно проверять посевы на присутствие в них психрофильных форм бактерий. Поэтому в этом случае делают два посева из одной пробы воды, один из которых инкубируют при 5⁰С, а второй - при 20⁰С. Если посевы дают сравнимые результаты, в дальнейшем посевы из зимних пробы воды инкубируют при 20°С для более быстрого получения результатов.

О наличии роста в каждом из разведений пробы судят по общему помутнению содержимого пробирок, иногда сопровождаемому и изме­нением его цвета. В случае учета углеводородокисляющих бактерий их рост может иметь место только в поверхностной пленке углеводорода. Иногда он имеет вид пристенного кольца. Рост микроорганизмов обыч­но имеет место не во всех повторностях разведений, поэтому для расчета численности микроорганизмов в пробе обычно пользуются таблицами Мак-Креди (приложение 1), построенными на основе методов вариационной стати­стики.

Полученные результаты записать в тетради и сделать выводы.

2. Выделение чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов

Чистые культуры получают рассевом на минеральные агаризованные среды, на поверхность которых наносят стерильную нефть или ее фракции.

Для учета бактерий использовали среду Чапека с сульфатом аммония (г): KCl - 0,5; MgSO₄ x 7Н₂О - 0,5; K₂HPO₄ - 1; FeSO₄ - 0,01; (NH₄)₂SO₄ - 2,0; CaCO₃ - 3; агар - 20 г; вода морская - 1л. Стерильное дизельное топливо (летнее) наносили в количестве 2 капель на поверхность среды в чашке и затем тщательно растирали по всей поверхности шпателем. Эти операции осуществляли до посева проб воды.

При количественном учете углеводородокисляющих бактерий на жидкой среде, после появления видимого роста микроорганизмов осуществляли высев из первого и последнего положительных разведений на агаризованную среду Чапека с дизельным топливом.

Идентификацию углеводородокисляющих бактерий проводят по культуральным, морфологическим и физиолого-биохимическим признакам. Полученные результаты записать в тетради и сделать вывод.

Контрольные вопросы

1. Раскройте понятие «углеводородокисляющие микроорганизмы».

2. За счёт сего происходит окисление углеводородов микроорганизмами?

3. От каких факторов зависит численность углеводородокисляющих микроорганизмов в водоёме?

4. Приведите примеры углеводородокисляющих микроорганизмов.

5. Для чего в среду для выращивания микроорганизмов добавляют дизельное топливо?

6. Каким методом определяют численность углеводородокисляющих микроорганизмов? Опишите этот метод.

 

Лабораторная работа №2

Эвтрофные и олиготрофные бактерии, как основные группы гетеротрофного бактериопланктона

Цель работы: определить количественный и качественный состав эвтрофных и олиготрофных микроорганизмов в воде морских (и/или пресных) водоёмов.

В основе круговорота элементов лежит органическое вещество, поэтому в водоемах доминируют гетеротрофные микробные сообщества, использующие в качестве источника энергии и конструктивного матери­ала органические соединения углерода.

В 1967 г. в экспериментах со штаммами морских гетеротрофных бактерий в хемостате было показано, что по способности к росту при различных концентрациях органических субстратов эти микроор­ганизмы можно разделить на две группы, одна из которых обладает способностью к росту при очень низком содержании субстрата в среде, а вторая - при высоком. При этом микроорганизмы второй группы не проявляли активности, но и не погибали при низких концентрациях органических субстратов в среде. Первая группа бакте­рий в получила название олигокарбофильных, а позднее - олиготрофных бактерий, вторая до сих пор разными исследователями именуется по разному - эвтрофными, сапрофитными, сапротрофными или копиотрофными бактериями.

Бактерии, существование которых в природе зависит от их способности размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода - до 0,1 мг/л в день, относятся к олиготрофам (греч. oligos - малый, trophe - пища). Организмы, не только способные расти на богатых питательных средах, но и предпочитающие изобилие пищевых веществ, относят к копиотрофам (греч. copiosus - изобилие, trophe - пища).

Олиготрофные виды встречаются среди представителей многих родов бактерий, их можно классифицировать в зависимости от особенностей отношения к органическому субстрату:

Характеристика:	Организмы:
Растут на органической среде только в первом посеве пробы, не выдерживают пересевов	Бактерии необычной морфологии: бобовидные, тороидальные, треугольные, шестиугольные, звездчатые клетки и т.п.
При первом посеве пробы растут только на бедных средах, но в последующих пересевах растут на богатых средах	Pseudomonas, Agrobacterium, Pho-tobacterium, Vibrio, Aeromonas, Flavobacterium, Micrococcus, Staphylo-coccus, Corynebacterium, Arthrobacter
Бактерии выделяют и культивируют на специальных бедных средах	Hyphomicrobium, Caulobacter, Mic-rocyclus, Leptothrix, Ochrobium, Metallogenium
Не культивируются в лабораторных условиях. Обнаружены в природных водоемах при изучении проб в электронном микроскопе	Простековые бактерии; некоторые бактерии с газовыми вакуолями

 

Олиготрофные бактерии являются типичными обитателями водоемов и почв. Многие олиготрофы обладают необычной морфологией, весьма сложным циклом развития и дифференцировкой клеток. Нередко олиготрофные бактерии снабжены простеками - окруженными клеточной стенкой выростами клетки. Такие бактерии называют простекобактериями.

Поскольку репродуктивный ответ олиготрофов на появление пищевых субстратов происходит медленнее, чем у эвтрофов, в условиях непрерывного пищевого потока, популяции эвтрофов используют запасы пищи, быстро размножаются и численно доминируют над олиготрофами. Однако если период поступления пищи был короче цикла репродукции эвтрофов, олиготрофы за счет использования накопленных пищевых резервов получают преимущество и начинают доминировать в истощенной среде. Олиготрофы весьма широко распространены в природе и во многих случаях численно доминируют над эвтрофовными бактериями.

Типичными представителями эвтрофных бактерий являются Е. coli и многие другие хорошо изученные гетеротрофные бактерии. Жизнеспособные клетки эвтрофных бактерий обычно легко можно обнаружить в олиготрофных местах обитания, где их устойчивое существование невозможно. В условиях голодания или при отсутствии достаточного количества пищи такие бактерии в течение некоторого времени сохраняют жизнеспособность. В отсутствие роста может продолжаться их деление и в результате образуются мелкие клетки, обозначаемые в литературе как «ультрамикробактери», «ультрамикроклетки», «минибактерии», «карлики». Через 12-24 ч после прикрепления к поверхности, ультрамикроклетки принимают форму и достигают размеров нормальной бактерии. Среди морских бактерий, образовывавших ультрамикроклетки, обнаружены представители родов Aeromonas, Alcaligenes, Fluvobacterium, Pseudomonas, Vibrio.

Микроорганизмы, приспособленные к жизни в олиготрофных местообитаниях, характеризуются высоким отношением поверхности к объему, способностью к образованию запасных веществ при избыточ­ном, а у некоторых даже при недостаточном поступлении субстрата; низкими тратами на поддержание, что позволяет переживать условия голодания и конкурировать с другими микроорганизмами при низких скоростях роста; наличием системы переносчиков, высокоспецифичных к определенным субстратам; специфической конститутивной системой метаболизма. Полный набор данных свойств обычно не встречается у какого-либо одного организма, но все они являются характерными для микроорганизмов, приспособленных к жизни в олиготрофных место­обитаниях. Показано, что олиготрофные бактерии способны усваивать гораздо более широкий спектр органических субстратов, чем эвтроф­ные, они более гибки в трофическом отношении.

Соответственно различаются и среды, предназначенные для учета олиготрофных и эвтрофных бактерий. Для выделения первых исполь­зуются питательные среды, содержащие от менее 1 мг до 50 мг органического вещества в литре. Четких границ между группами эвтрофных и олиготрофных бактерий, основываясь только на их способности к росту на средах с высоким или низким содержанием сложных органических веществ (пептона, дрож­жевого экстракта и т.д.), провести, по-видимому, невозможно. Считается деление на эвтрофных и олиготрофных бакте­рий вполне оправданным, поскольку раздельный учет численности бак­терий обеих групп позволяет получить дополнительную информацию, например - о трофности водоема.

Таким образом, соотношение численности эвтрофных и олиготроф­ных бактерий имеет важное практическое значение для характеристики состояния водоемов.

 

 

Задание:

- нарисовать схему посева для количественного определения эвтрофных и олиготрофных микроорганизмов;

- определить количество вышеперечисленных микроорганизмов в 1 мл морской и/или пресной воде;

- выделить чистые культуры эвтрофных и олиготрофных микроорганизмов;

Материалы и оборудование: солиNaCl, MgSО₄x7Н₂О, КС1, К₂НРО₄, Na₂HPО₄, NH₄NО₃, КН₂РО₄х3Н₂О, FeSО₄x7Н₂О, рыбный бульон (РБ), дрожжевой экстракт, пептон, пробирки, стерильные градуированные пипетки на 1 мл; пинцеты, стерильные шпатели, микроскопы и все необходимое для приготовления окрашенных пре­паратов и микроскопирования.

Методика проведения работы:

1. Определение численности эвтрофных и олиготрофных микроорганизмов

Для учета численности эвтрофных бактерий в морских водах наибо­лее часто используется модифицированная среда Зобелла следу­ющего состава (г): пептон - 5,0; КН₂РО₄х3Н₂0 - 0,084; FeS0₄x7Н₂О - 0,185; NaCl - 24,0; MgSO₄х7Н₂О-1,0; КС1-0,7; дрожжевой экстракт -1,0; вода дистиллированная ^_ 1 л. Соленость среды при необходимости может быть понижена за счет уменьшения содержания в среде NaCl. Эту же среду можно использо­вать для учета эвтрофных бактерий в пресных водоемах, исключив из ее состава NaCl. Так же для учета численности эвтрофных бактерий в морских водах может быть использована среда – рыбный бульон.

Для учета олиготрофных бактерий может быть рекомендована моди­фицированная среда ММС следующего состава (г): NaCl - 7,0; MgSO₄х7Н₂О - 1,0; КС1-0,7; К₇НРО₄-2,0; Na₂HPО₄-3,0; NH₄NО₃ - 1,0; вода дистиллированная - 1,0 л. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляют 50 мг/л дрожжевого экстракта.

Наиболее распространенным методом учета численностиэвтрофных и олиготрофных бактерий, способных к росту на питательных средах, является метод предельных разведений. См. лабораторную работу №1.

Время инкубации проб воды зависит от состава среды и исходной численности микроорганизмов в пробе воды. Как правило, для эвтрофных бактерий время инкубации составляет не более 7 суток, а для олиготрофных бактерий может достигать 1 месяц. Пробирки с разведениями инкубируют при комнатной температуре, желательно не выше 20⁰С. В зимний период желательно проверять посевы на присутствие в них психрофильных форм бактерий. Поэтому в этом случае делают два посева из одной пробы воды, один из которых инкубируют при 5⁰С, а второй - при 20⁰С.

О наличии роста в каждом из разведений пробы судят по общему помутнению содержимого пробирок, иногда сопровождаемому и изме­нением его цвета. Рост микроорганизмов обыч­но имеет место не во всех повторностях разведений, поэтому для расчета численности микроорганизмов в пробе обычно пользуются таблицами Мак-Креди (приложение 1), построенными на основе методов вариационной стати­стики.

Полученные результаты записать в тетради и сделать выводы.

Контрольные вопросы

1. Раскройте понятие «эвтрофные» и «олиготрофные» микроорганизмы.

2. Каким методом определяют численность эвтрофных и олиготрофных микроорганизмов? Опишите этот метод.

3. В чем состоит специфика олиготрофных бактерий?

Лабораторная работа №3

Оценка качества воды

Цель работы: определить общее микробное число в водоёме, расположенном в рекреационной зоне города с помощью метода мембранных фильтров и глубинного метода посева.

В связи с тем, что определение патогенных бактерий при биологическом анализе воды представляет собой непростую и трудо­емкую задачу, в качестве критерия бактериологической загряз­ненности используют подсчет общего числа образующих колонии бактерий в 1 мл воды. Полученное значение называют общим микробным числом.

Выявление микроорганизмов и их учет можно произвести пу­тем высева проб в простые жидкие и агаризованные питательные среды. Для учета некоторых гетеротрофных^* сапротрофных^** бак­терий используют рыбопептонный агар (РПА). Обычно число сап­ротрофных микроорганизмов, выращенных на РПА, соответствует степени загрязненности воды органическими веществами и кос­венно характеризует ее санитарное состояние. Для выделения бак­терий и подсчета общего микробного числа в основном использу­ют метод фильтрации через мембрану (рис.1) и глубинным посевом.

Принципметода заключа­ется в том, что пробы воды (объем зависит от типа водоема и степени его эвтрофикации) фильтруют через мембранные фильт­ры. Затем фильтры стерильно раскладывают на поверхность агаризованной среды для проращивания осевших на них микроорганизмов. После инкубации подсчитывают количество колоний, вы­росших на поверхности мембранных фильтров.

Задание:

- нарисовать схему посева для глубинного метода посева;

- определить общее микробное число в водоёме методом мембранных фильтров;

^* Гетеротрофные организмы (от гетеро... и... троф) — организмы, исполь­зующие в качестве источника углерода экзогенные органические соединения. Участвуют в минерализации органических соединений в биосфере. К ним отно­сятся животные, большинство бактерий, актиномицеты, грибы, а также неко­торые безхлорофильные высшие растения, в том числе паразитирующие цветко­вые и некоторые водоросли.

^** Сапротрофы (от греч. dapros — гнилой и ...троф) — гетеротрофные орга­низмы, использующие для питания органические соединения мертвых тел или выделения (экскременты) животных.

 

- определить общее микробное число в водоёме глубинным методом посева;

- сделать вывод о качестве воды природного водоема.

Материалы и оборудование: стерильные чашки Петри, стерильные мембранные фильтры; фильтровальный прибор; водоструйный на­сос; рыбопептонный агар (РПА); стерильный пинцет; 70%-й спирт; спиртовка; термостат; стерильные колбы.

Методика проведения работы

Пробы воды для микробиологического исследования отбирают с соблюдением правил стерильности в стерильную стеклянную посуду с притертыми или ватно-марлевыми пробками. В стоячих водоемах пробы отбирают с помощью батометров, погруженных на уровень 10-15 см от дна,

в проточных водоемах - около бере­га и в центре течения. При плановом санитарном контроле отби­рают не менее 500 мл воды. Микробиологическое исследование выполняют не позднее 2 ч с момента взятия пробы (либо при условии хранения при температурах 1-5 °С не более 6 ч).

Фильтры стерилизуют кипячением в дистиллированной воде по 1-5 мин. Фильтры с дефектами отбрасывают.

Сделать серию последовательных разведений (10²-10⁶) воды из водоема (в зависимости от предполагаемой степени загрязне­ния). По 10 мл воды из каждого разведения пропустить через мем­бранные фильтры, наложенные на предварительно профламбированную поверхность фильтровального прибора, исполь­зуя водоструйный насос. В результате на поверхности мембраны остаются все находящиеся в воде бактерии (рис.1). Каждую пробу анали­зировать в 2-кратной повторности. Разлить по 20 мл РПА в чашки Петри.

Мембранные фильтры с бактериями стерильным пинцетом поместить фильтратом на поверхность питательной среды в чаш­ки Петри на 24 ч. Чашки перевернуть и инкубировать при темпе­ратуре 30-37 °С в термостате.

 

Рис.1. Схема учёта микроорганизмов методом мембранных фильтров

 

По истечении времени инкубации подсчитать количество колоний микроорганизмов на поверхности питательного агара, которые можно наблюдать на чашках Петри. Подсчет сле­дует провести на всех параллельных чашках и найти среднее зна­чение.

Численность клеток гетеротрофных микроорганизмов в 1 мл воды рассчитать по формуле А = ^NR/_W, где N - число колоний на чашке, кл; R- разведение, из которого произведен посев; 10 - пересчет на 1 мл.

Посев можно провести глубинным методом. Для этого по 1 мл исследуемой воды из разведений 10²-10⁶ внести в чашки Петри, залить сверху расплавленным и охлажденным до 45-50°С РПА, круговыми движениями по столу размешать посев. Дать за­стыть, перевернуть чашку и инкубировать в термостате 24 ч при 30-37°С. Подсчет общего микробного числа сделать с учетом раз­ведений.

После подсчета всех колоний на чашке их можно сгруппиро­вать по культуральным признакам, сделать мазки, прокрасить по Граму для оценки морфологических характеристик и определить микроорганизмы до рода (или до вида).

 

Таблица 1

Классы качества воды природных водоемов по бактериальным показателям

 

	Классы качества воды
Показатель	предельно чистая	чистая	удовлетвори­тельно чистая	загрязнен­ная	грязная
Численность бактерий планктона, млн кл/мл	<0,3	0,3-1,5	1,6-5,0	5,1-11,0	> 11,0
Численность гетеротрофных бактерий, тыс. кл/мл	<0,1	0,1-1,0	1,1-5,0	5,1-10,0	> 10,0
Численность бактерий груп­пы кишечной палочки, тыс. кл/мл	< 0,003	0,003-2,0	2,1-10,0	11,0-100	> 100

Высо­кое микробное число свидетельствует об общей бактериологической загрязненности воды и высокой вероятности наличия пато­генных организмов (табл.1). По табл. 1 определить, к какому классу качества относится вода из тестируемого водоема, находящегося в рекреационной зоне города. Полученные результаты записать в тетради и сделать вывод.

Контрольные вопросы

1. Раскройте понятия «гетеротрофные организмы» и «сапротрофы».

2. Что называют общим микробным числом?

3. О чём свидетельствует высо­кое микробное число?

4. В чём сущность метода мембранных фильтров?

5. Расскажите о глубинном методе посева в плотные среды.

6. Сравните полученные результаты, полученные с помощью метода мембранных фильтров и глубинного метода посева. Какой из методов, по вашему мнению, лучше? Почему?

 

Лабораторная работа №4

Микроорганизмы, обитающие в ризосфере и ризоплане растений

Цель работы: познакомиться с ризосферной и корневой микрофлорой растений.

Чем ближе к корневой системе расположена почва, тем больше бактерий в ней содержится. Особенно много микроорганизмов на поверхности корня - в ризоплане (от греч. rhiza - корень, plane - ровно). Здесь обитают преимущественно эпифиты (от греч. epi - над, на; phyton - растение). В слое почвы (2-3 мм), прилегающем к корням, получившем название ризосферы, в ка­честве дополнительного источника питания бактерии используют продукты распада отмерших тканей корня. Питательными веществами для бактерий, обитающих на корнях, служат продукты экзосмоса растений (корневые выделения).

В ризосфере могут развиваться те же формы бактерий, что и в почве, отдаленной от корней, но на корнях обычно преобладают неспороносные палочки рода Pseudomonas, при­чем на корнях злаков, бобовых и других растений поселяются неодинаковые их виды и разновидности. Это объясняется раз­личием в обмене веществ у отдельных видов растений.

В прикорневой зоне растений бактерии в известной мере играют роль санитаров, очищая ее от продуктов метаболизма растений. Минерализуя органические остатки, они в то же время переводят ряд элементов питания в доступную для рас­тений форму. Отдельные виды бактерий, развивающиеся на корнях, продуцируя ростовые вещества и витамины, оказыва­ют положительное влияние на рост растений. Однако многие бактерии корневой зоны обладают денитрифицирующей спо­собностью и в условиях недостаточной аэрации могут обусло­вить значительные потери азота из почвы

Задание:

- нарисовать схему посева для двух опытов;

- определить количество микроорганизмов в ризосфере и на корнях;

Материалы и оборудование: Почва с растениями, пинцеты, ножницы, колбы на 250 мл (7 шт.), колба на 700 мл (1 шт.) содержащие 100 мл стерильной водопроводной воды, крючки из проволоки, стерильные градуированные пипетки на 1 мл, стерильные шпатели, лупы, микроскопы и все необходимое для приготовления окрашенных пре­паратов и микроскопирования.

Методика проведения работы:

Опыт №1. Учет ризосферной и корневой микрофлоры методом последовательных отмываний корней (по Теппер)

Из выкопанных монолитов почвы с растениями стерильными пинцетом и ножницами отбирают 1 г молодых корней при­мерно одного диаметра с приставшими к ним частицами поч­вы.

Корни помещают в 1-ю колбу со 100 мл стерильной во­допроводной воды и взбалтывают 2 мин. Стерильным крюч­ком, сделанным из обычной бактериологической иглы, корни извлекают и переносят последовательно во 2-ю, 3-ю и т. д. до 7-й колбы, также содержащие по 100 мл стерильной водопро­водной воды. В каждой колбе корни отмывают по 2 мин.

Из каждой колбы отдельно стерильной пипеткой берут 1 мл отмывной воды, помещают в чашку Петри и заливают остуженным до 45⁰С РПА. Чашки помещают в термостат при 30⁰С. Спустя 72 ч чашки можно анализировать.

По мере отмывания корней численность бактерий не убывает, а в ряде случаев - даже увеличивается. Это свиде­тельствует о тесной связи эпифитных микроорганизмов с тка­нями растений, для которых они служат естественным защит­ным барьером. В чашках с посевом из первых отмываний мно­го крупных колоний спороносных форм бактерий - это могут быть и почвенные обитатели. По мере отмывания количество колоний бациллярных форм уменьшается и возрастает число мелкоточечных колоний неспорообразующих форм рода Pseudomonas.

Опыт №2. Для определения количества микроорганизмов в ризосфере и на корнях суспензию из 1-й колбы (1-го отмывания) допол­нительно взбалтывают 5 мин. Затем из нее готовят разведения, из которых делают поверхностные посевы (0,1 мл на РПА). Содержимое ос­тальных 6 колб сливают вместе и, также приготовив последо­вательные разведения, проводят из них поверхностные посевы на РПА.

Для подсчета

12Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: