Рис. 1 Первый цикл ПЦР. Рис. 2 Схема амплификации ДНК в течение трех циклов ПЦР

Рис. 1 Первый цикл ПЦР

После расхождения цепей ДНК охлаждают (примерно до 40-75°С) в присутствии переизбытка праймеров, что позволяет им гибридизоваться с комплементарными последовательностями на цепях ДНК. Затем смесь инкубируется с ДНК-полимеразой и 4-мя видами dNTP, чтобы ДНК синтезировалась, начиная с двух праймеров. Затем цикл начинается заново с нагревания, чтобы отделить вновь синтезированные цепи ДНК друг от друга. Поскольку процесс плавления ДНК требует использования высоких температур, данная методика требует использовать особые виды ДНК-полимераз, способные выдерживать нагревание до 96°С. Большинство известных ДНК-полимераз, как и других ферментов, при нагревании до столь высоких температур подвергаются денатурации и теряют биологическую активность. Поэтому для проведения ПЦР используют специальные ДНК-полимеразы, выделенные из термофильных бактерий, которые устойчивы к действию гораздо более высоких температур, чем эукариотические ДНК-полимеразы. Это снимает необходимость добавления новой порции фермента после каждого цикла ПЦР.

Долгое время для проведения ПЦР использовались отдельные термостабильные ДНК полимеразы: Taq, Tth, Pwo, Pfu и др. В настоящее время, для различных целей, в ПЦР используют смеси полимераз с различными свойствами, включая искусственно полученные модификации природных ферментов. Большинство используемых в настоящее время ферментов получены на основе технологии рекомбинантных ДНК.

Taq-полимераза была выделена из термофильной эубактерии Thermus aquaticus. Фермент представляет собой одну полипептидную цепь с молекулярной массой 95 кДа. Данный фермент эффективно амплифицирует фрагменты длиной 3000-5000 п. н. и обладает хорошо выраженной 5ʹ -3ʹ -экзонуклеазной активностью, но не проявляет корректирующей 3ʹ -5ʹ -экзонуклеазной активности. Получаемые при использовании Taq-полимеразы фрагменты ДНК, как правило, содержат выступающий 3ʹ -концевой нуклеотид (чаще всего А), который нематрично присоединяется ферментом. Это свойство Taq-полимеразы используют для эффективного клонирования продуктов ПЦР в линеаризованные векторы с 3ʹ -выступающим Т.

Tth-полимераза была выделена из термофильной эубактерии Thermus thermophilus. Это также высокопроцессивный фермент, амплифицирующий до 3000 п. н., имеющий молекулярную массу порядка 94 кДа, обладающий хорошо выраженной 5ʹ -3ʹ -экзонуклеазной активностью, но не проявляющий корректирующей 3ʹ -5ʹ -экзонуклеазной активности. Особенностью этой полимеразы является наличие ревертазной активности. Данный фермент обычно используют для проведения ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR).

Pwo-полимераза была выделена из гипертермофильной архебактерии Pyrococcus woesei. Молекулярная масса фермента около 90 кДа. Это процессивный фермент, обеспечивающий амплификацию до 3000 п. н., не проявляющий 5ʹ -3ʹ -экзонуклеазной активности, но обладающий выраженной 3ʹ -5ʹ -экзонуклеазной активностью.

Pfu-полимераза получена из Pyrococcus furiosus. Молекулярная масса около 92 кДа. Pfu-полимераза характеризуется сравнительной процессивностью и эффективно амплифицирует фрагменты до 1000 п. н. Фермент обладает 3ʹ -5ʹ -экзонуклеазной активностью, наличие которой делает его пригодным для тех вариантов ПЦР, в которых необходимо получение продукта с высокой точностью синтеза (например, для последующего секвенирования).

Рис. 2 Схема амплификации ДНК в течение трех циклов ПЦР

Помимо ДНК-матрицы, ДНК-полимеразы и праймеров, необходимыми компонентами реакционной смеси являются dNTP 4-х типов (dATP, dGTP, dCTP и dTTP), а также ионы Mg²⁺ (чаще всего в форме MgCl₂).

После множества циклов амплификации образуется большое число, обычно миллиарды копий исходной последовательности (Рис. 2).

В результате каждого цикла количество копий амплифицированного фрагмента увеличивается как 2ⁿ. При этом относительная концентрация целевых последовательностей многократно возрастает (показано желтым), в то время как доля нецелевых участков прогрессивно уменьшается.

ПЦР крайне чувствительна и может зарегистрировать присутствие единичной копии последовательности ДНК в образце, амплифицируя ее так, что эту ДНК становится возможным увидеть с помощью, например, окрашивания бромистым этидием (интеркалирующего агента, встраивающегося между цепями двойной спирали ДНК и вызывающего ее сверхспирализацию, в результате чего образовавшийся комплекс приобретает способность флуоресцировать в УФ-свете) после разделения гель-электрофорезом.