 |
26. Физико-химические свойства ферментов, используемых в ИФА. Глюкозооксидаза.
|
|
|
|
26. Физико-химические свойства ферментов, используемых в ИФА. Глюкозооксидаза.
Требования, предъявляемые к выбору ферментных меток в ИФА:
А) высокая специфичность и удельная каталитическая активность, позволяющая определять ферментативную метку в низких концентрациях.
Б) доступность ферментов; возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую фермент. акт-ть после хим. модификации при получении конъюгата с Ат или Аг.
В) стабильность в оптим. усл. Взаимдействия Аг с Ат.
Г) простота и чувствительность метода определения конц. фермента.
В ИФА введение ферм. метки осуществляют путем ковалентного связывания мол. фермента с мол. Аг или Ат, таким образом чтобы не происходило инактивации фермента.
Глюкозооксидаза.
Чаще из Aspergillus niger. Представляет собой гликопротеин (16% углефодных гр. ), м. м. =160. 000, в состав входит 2 мол. ФАД. Коэф. молярного поглощения фермента при λ =450 нм – 1, 41 104 М-1см-1. В нативном состоянии сульфгидрильные группы в молекуле фермента не обнаруживаются, однако после денатурации в 8 М мочевине титруются 1-2 SH-группы на молекулу белка. Фермент обладает высокой стабильностью и сохраняет акт-ть при хранении в течение неск. лет в замороженном виде в конц. 10 мг/мл.
Ферм. катализирует р-цию окисления β -D-клюкозы с кислородом с образованием перекиси водорода:
β -D-клюкоза+Н2О+О2=Н2О2+D-глюконо-δ -лактон
2-D-арабиноза, 2-дезокси-D-глюкоза и ионы Ag+, Hg2+, Cu2+ являются ингибиторами, рН оптимум=5, 5.
Принцип измерения каталитической активности основан на регистрации продукта р-ции – перекиси водорода с помощью пероксидазы хрена.
27. Определения аффинности антител путем измерения гашения флуоресценции
|
|
|
Аффинность — термодинамическая характеристика, количественно описывающая силу взаимодействия веществ.
Основан на гашении флуоресценции. Антитела и их взаимодействии с гаптеном. Длина волны возбуждения 280-295 нм. Длина волны испускания 345 нм. Если вводят в систему антиген, то происходит связывания с антиген связывающей системой. Происходит перенос энергии и исчезает флуоресценция. Не для всех антигенов этот метод подходит, т. к. происходит перекрытие (в качестве антигена будет выступать триптофан, т. к. он сам будет флуоресцировать). Для этого метода обычно используют 2, 4-динитрофенол. Полное тушение, которое достигается при пороговой концентрации значении. Степень гашения зависит от концентрации активных центров антител, константы их ассоциации с антигеном и пропорциональна концентрации, образовавшихся специфических комплексов.
Преимущества:
небольшое количество антитела (в 10 раз меньше, чем в остальных подходах).
Процесс быстрый (10-30 минут).
Антитело можно использовать в экстремальных условиях (длительное воздействие температуры, экстремальные значения pH).
Недостатки:
Высокоочищенные антитела следует использовать.
Круг гаптенов ограничен.
Менее точный метод.
b=n∙ [at]∙ Qi/Qmax
Qi- гашение флуор после внесения соотв гапнета
B-кол-во связей гаптена
At-моляр конц ат
N-число уч связ на мол ат
Qmax-мах гашение флуор при полном связ гаптена
28. Классификация методов ИФА. Общие принципы
Методы ИФА разделяются на гетерогенные и гомогенные, т. е. по принципу проведения всех стадий анализа- с участием твёрдой фазы или же только в растворе.
Первичным процессом является стадия узнавания анализируемого соединения специфического к нему антителом. Так как процесс образования иммунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленным аффиностью.
|
|
|
В случае анализа антигенов для проведения оценки существуют подходы: 1. Прямое измерение концентрации образовавшихся комплексов. 2. Определение концентрации оставшихся свободными, т. е. не вступивших в реакцию комплексообразования с антигеном антител.
Один из путей визуализации образования комплекса является использование меченных соединений, в которых метка может легко детектироваться в концентрациях, сопоставимых с определяемой концентрацией анализируемого соединения. От типа метки зависит название анализа-радиоиммунологический анализ, флоорисцентный иммуноанализ, имунокофакторный анализ.
Второй общей стадий является формирование связи меченного ферментом соединений со специфическим комплексом или свободными центрами связывания. Последним процессам является трансформация ферменты метки в соответствующий сигнал, измеряемый различными физхим методами.
В первой группе методов ИФА (тип1-определение специфических комплексов) ферментная метка находится в образовавшемся специфическом комплексе анализируемого антигена и антитела, поэтому возрастание концентрации определяемого соединения будет сопровождать увлечением концентрации образующегося специфического иммунохимического комплекса.
Во второй группе методов (тип2-определение свободных центров связывание антител) с помощью ферментной метки выявляются оставшиеся свободными центры связывания.
Классификация методов ИФА по типу реагентов, используемых на первой стадии анализа. Если на первой стадии в системе присутствуют только анализируем соединения и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела) то метод является неконкурентный.
Для неконкурентной анализа типа 1 оптимальным является соотношение компонентов, при котором концентрация центров связывания значительно превышает концентрацию определяем ого соединения. В этом случае при повышении концентрации центров связывания равновесия в системе будет смешать с в сторону образования имунохимических комплексов.
Условием для не конкурентной анализа типа 2 является соблюдения соотношения избытка или сравнимо концентрации определяем ого соединения и мест спецефическом связывания.
|
|
|
Если на первой стадии анализа в системе одновременно присутствует анализируемого соединение и его аналог (меченного ферментом анализируемого соединение или анализируемого соединение, иммобилизованное на твёрдо фазе), конкурирующие за имеющиеся в относительно недостатке центры специфического связывания, то метод является конкурентным. Необходимым условиям конкурентного метода является недостаток центров специфического связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого соединения и его аналога.
Разделение по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакции делят на 2 группы гомогенные и гетерогенные. Если все реакции протекают в растворе то метод является гомогенным. Гетерогенные методы в которых анализ проводиться в двухфазной системе включают обязательную стадию разделения свободного и образовавшегося специфический комплекс меченного соединения, которые находятся в разных фазах.
Разделения гетерогенные методов по характеру проведения первой стадии узнавания, которая является определяющий для всего анализа. Если на первой стадии антиген или антитела используют в иммобилизованном состоянии, формирование специфическим иммунокомплекса проходит на твёрдо фазе то метод относится к твердофазным. Если на первой стадии анализа все происходит в растворе, а затем для целей разделения используют твёрдо фазу с иммобилизованным реагентом, то такие методы называют гомогенно-гетерогенные.
|
|
|
