 |
Количественное определение холестерола
|
|
|
|
Лабораторная работа № 10
| Тема: | 1. Нейтральные жиры. Стероиды |
| 2. Идентификация и методы количественного определения жирных кислот и холестерина | |
| Цель работы: | Изучение химических свойств липидов. Освоение методов идентификации липидов и количественного определения жирных кислот и холестерина |
Оборудование и материалы:
· Спектрофотометр SOLAR
· Кюветы полистирольные
· Термостат
· Центрифуга UNIVERSAL 30RF
· Весы центрифужные
· Пробирки центрифужные
· Пипетки стеклянные на 1 и 5 мл
· Микропипетки автоматические
· Цилиндры мерные на 250 и 100 мл
· Пробирки стеклянные химические
· Штативы для пробирок
· Предметное стекло
· Шприц с длинной иглой
· Бумага фильтровальная
· палочки стеклянные
Реактивы:
· Жир (масло)
· Воск
· Сыворотка крови
· Холестерол, 1%-ный хлороформный раствор
· Желчные кислоты, раствор
· Бычий сывороточный альбумин (БСА), раствор
· Гидроксид натрия (NaOH), 10%-ный раствор, 15%-ный спиртовой раствор
· Гидрокарбонат натрия (NaHCO3), раствор
· Борная кислота, кристаллическая (либо безводный MgSO4, либо безводный KHSO4)
· Оксид серебра (Ag2O), аммиачный раствор
· Осмиевая кислота, 1%-ный раствор
· Фуксинсернистая кислота, раствор
· Судан III, раствор
· Медный реактив: СН3СООН / СuNO3 / триэтаноламин в соотношении 1 / 10 / 9
· Диэтилдитиокарбамат (ДЭТК), 0,1%-ный раствор в н-бутаноле
· Реактив Либерман-Бурхард
· Мыло, раствор
· Бромная вода
· Сера, порошок
· Сахароза, 5%-ный раствор
· Эфир
· Керосин (бензин)
· Хлороформ
· Спирт (этиловый), 96%-ный
· Серная кислота (H2SO4), конц.
· Соляная кислота (HCl), 10%-ный раствор
· Пальмитиновая (стеариновая) кислота, стандартный раствор, 50 мкг/мл
· Холестерол, стандартный раствор, 4,68 ммоль/л
|
|
|
· Вода дистиллированная
Теоретическая часть
Липиды
Липиды вместе с белками и углеводами составляют основную массу органического вещества живой клетки. В высокой концентрации липиды (особенно фосфолипиды) обнаруживаются в различных органах животных и человека: в головном и спинном мозге, крови, печени, сердце, почках и др. Эти соединения входят в состав всех структурных элементов клетки, в первую очередь клеточных (плазматических) мембран и мембран субклеточных частиц. С участием липидов протекают такие важнейшие биохимические процессы, как передача нервных импульсов, активный перенос через мембраны, транспорт жиров в плазме крови и многие ферментативные процессы, особенно те, которые связаны с транспортом электронов и системой окислительного фосфорилирования.
Многообразие функций липидов в жизни клетки определяет ту важную роль, которую они выполняют в энергетических процессах, в защитных реакциях организма, его развитии и старении, в развитии различных патологических состояний и т.д.
В структурном отношении липиды и многие жироподобные вещества (называемые иногда липоидами) представляют собой весьма гетерогенную группу органических соединений, которые, тем не менее, так или иначе связаны с длинноцепочечными карбоновыми (высшими жирными) кислотами. Наиболее общими свойствами липидов являются:
1) их нерастворимость в воде (хотя среди липидов имеются такие, которые способны образовывать в полярных растворителях относительно устойчивые эмульсии);
2) их растворимость в неполярных растворителях – эфире, хлороформе, бензоле.
Классификация и структура липидов
В последние десятилетия были достигнуты значительные успехи в изучении химии и биохимии липидов. Однако до настоящего времени отсутствуют строгая классификация липидов и критерии принадлежности к данному классу биологически активных природных соединений. Так, к липидам пытаются отнести все вещества гидрофобного характера, включая не только производные высших жирных кислот, спиртов и альдегидов, но и терпены, стероиды, жирорастворимые витамины, пигменты и другие группы липофильных соединений клетки. Часто классификацию липидов осуществляют также на основе их растворимости, что, впрочем, совершенно не отражает их строения.
|
|
|
Отсутствие единой классификации липидов, по-видимому, в первую очередь обусловлено крайним разнообразием их структурных компонентов. В состав липидов входят высшие жирные кислоты, спирты, в том числе высшие жирные спирты, альдегиды, различные полиолы, углеводы, азотистые основания, аминодиолы, холестерол, аминокислоты, фосфорная и фосфоновая кислоты и другие соединения, между которыми могут образовываться разнообразные связи (сложноэфирная, простая эфирная, гликозидная, амидная, фосфодиэфирная, фосфоноэфирная и др.). Если учесть, что эти компоненты могут иметь разную длину цепочки атомов углерода, неодинаковую степень ненасыщенности, различные функциональные группы и конфигурации двойных связей, то станет понятным чрезвычайное разнообразие структуры липидов.
К липидам целесообразно относить природные биологически активные производные высших жирных кислот, спиртов и альдегидов. Как правило, при классификации липидов в последнее время пользуются именно таким определением. На основании указанного подхода их принято подразделять на простые, или нейтральные липиды, сложные липиды (представленные, главным образом, фосфолипидами), сфинголипиды, а также стероиды (стерины, стериды, стеролы) и их эфиры с жирными кислотами.
Простые, или нейтральные липиды
Простые, или нейтральные липиды, в свою очередь, подразделяют на жиры (триацилглицеролы) и воска. Триацилглицеролы представляют собой сложные эфиры трех молекул высших жирных кислот с трехатомным спиртом глицеролом. В зависимости от насыщенности или ненасыщенности жирных кислот, входящих в состав триацилглицеролов, их делят на собственно жиры и масла соответственно. Триацилглицеролы являются основным компонентом жировых депо растительных и животных клеток. Это неполярные, гидрофобные соединения, не содержащие заряженных или сильно полярных групп, и поэтому нерастворимы в воде.
|
|
|
Воска –тожесложные эфиры, образуемые длинноцепочечными насыщенными или ненасыщенными жирными кислотами (с числом атомов углерода от 14 до 36) и длинноцепочечными одноатомными спиртами (с числом атомов от 16 до 22). У позвоночных животных воска, секретируемые кожными железами, выполняют функцию защитного покрытия, которое смазывает, смачивает кожу и предохраняет ее от действия воды. У птиц, особенно водоплавающих, воска копчиковой железы придают перьевому покрытию водоотталкивающие свойства. Воска вырабатываются и используются в очень больших количествах морскими организмами, особенно планктонными, у которых они служат основной формой накопления высококалорийного клеточного топлива. Именно поэтому воска играют важную роль в морских пищевых цепях как основной источник липидов.
Сложные, или полярные липиды (фосфолипиды)
Существует несколько классов сложных мембранных липидов. Они отличаются от триацилглицеролов тем, что наряду с углеводородными цепями содержат одну или несколько сильно полярных «головок». На этом основании их часто называют полярными липидами. Фосфолипиды служат основными структурными элементами мембран. Как видно из названия, липиды этой группы содержат фосфор в виде остатка фосфорной кислоты. Роль основного фосфолипидного компонента играют фосфоглицериды, в состав которых входят два остатка жирных кислот, этерифицирующих первую и вторую гидроксильные группы глицерола. Третья гидроксильная группа глицерола образует сложноэфирную связь с фосфорной кислотой. Кроме того, с остатком фосфорной кислоты сложноэфирной связью взаимодействует тот или иной спирт, что дает возможность различать несколько классов фосфолипидов (см. лабораторную работу №11). На основании приведенного описания фосфолипиды следует отнести к группе липидов, которые имеют общее название глицерофосфолипидов.
Сфинголипиды
Следующий важнейший класс мембранных липидов – сфинголипиды. Они тоже имеют полярную «головку» и два неполярных хвоста, однако не содержат глицерола. Основу структуры сфинголипидов составляет сфингозин (или, в некоторых случаях, его производные) – аминоспирт с длинной углеводородной цепью, имеющей одну двойную связь. В сфинголипидах сфингозин соединяется с жирной кислотой амидной связью, образуя при этом церамид (N-ацилсфингозин). В целом сфингозин служит предшественником ряда длинноцепочечных аминоспиртов, присутствующих в различных сфинголипидах. Например, у млекопитающих наиболее часто встречаются сфингозин и дигидросфингозин, не имеющий двойной связи. В сфинголипидах полярная «головка» присоединяется к первичной спиртовой группе сфингозина. Выделяют три подкласса сфинголипидов: сфингомиелины, цереброзиды и ганглиозиды.
|
|
|
Наиболее распространенными и просто устроенными сфинголипидами являются сфингомиелины, у которых первичная спиртовая группа сфингозина этерифицирована (т.е. образует сложноэфирную связь) с фосфорилхолином. Тот факт, что сфингомиелины содержат остаток фосфорной кислоты, отчасти дает основание относить эти соединения к фосфолипидам. На рис. 10.1 показаны пространственные модели фосфатидилхолина и сфингомиелина.
Рис. 10.1. Пространственные модели фосфатидилхолина (А) и сфингомиелина (В)
Цереброзиды и ганглиозиды часто называют гликолипидами. Как следует из названия, гликолипиды (цереброзиды и ганглиозиды) – это липиды, содержащие углеводную часть. Аминогруппа сфингозина, как и в сфингомиелинах, ацилирована жирной кислотой. Отличие гликолипидов от сфингомиелина заключается в природе компонента, присоединенного к первичному гидроксилу сфингозинового скелета. В гликолипидах в этом положении находится один или несколько остатков моносахаридов. Простейшими гликолипидами являются цереброзиды, содержащие только один остаток моносахарида (чаще всего глюкозу или галактозу). В более сложных гликолипидах – ганглиозидах – присутствует разветвленная цепочка из нескольких (вплоть до семи) остатков моносахаридов. На рис. 10.2 приведено строение ганглиозида GM1.
Рис. 10.2. Строение ганглиозида GМ1: Gal – галактоза; GalNAc – N–ацетилгалактозамин; Glc – глюкоза; NAN – N–ацетилнейраминовая кислота. Над линиями, обозначающими связи между моносахаридами, указан тип этих связей, например β1,4
Стероиды
Стероиды – сложные жирорастворимые соединения, молекулы которых состоят из четырех конденсированных колец, представляющих собой базовое ядро, называемое циклопентанпергидрофенантреном. Подавляющее большинство стероидных соединений являются производными циклопентанпергидрофенантрена, метилированного по 10-му и 13-му положениям базового ядра (рис. 10.3).
|
|
|
Рис. 10.3. Структура циклопентанпергидрофенантренового ядра стероидов. Показаны общепринятое обозначение колец и нумерация углеродных атомов стероидов
Важную группу среди них составляют стероиды, несущие в положении С3 гидроксильную группу и отличающиеся только содержанием атомов углерода в боковой цепи, присоединяющейся к атому С17 в кольце D. Это так называемые стеролы или стероидные спирты. Данную группу стероидов подразделяют на:
1) стерины, или собственно стеролы, имеющие боковую цепь, состоящую из 8 атомов углерода, к ним относится, например, холестерин (холестерол);
2) стериды, представляющие собой сложные эфиры стеринов и высших жирных кислот;
3) желчные кислоты и их соли, обладающие мощным эмульгирующим действием на жиры и, соответственно, принимающие непосредственное участие в процессах переваривания липидов;
4) половые гормоны – стероиды-регуляторы, не имеющие боковой цепи;
5) кортикостероиды, содержащие боковую цепь из двух атомов углерода.
Основная масса стеринов в организме человека представлена холестерином – одноатомным циклическим спиртом, содержащим 27 атомов углерода и способным образовывать с жирными кислотами сложные жиры (холестериды). Холестерин (рис. 10.4) содержится в желчи, в плазме крови (3,9–6,5 ммоль/л), входит в состав клеточных мембран, определяя их вязкость, является компонентом липопротеинов.
Рис. 10.4. Структура холестерола
Предшественники и производные липидов
Сюда относятся жирные кислоты, глицерол, стероиды, прочие спирты (кроме глицерола, сфингозина и стеролов), альдегиды жирных кислот и кетоновые тела, углеводороды, жирорастворимые витамины и гормоны.
Жирные кислоты
Уже приводилось определение, согласно которому липиды – это природные биологически активные соединения, производные высших жирных кислот, спиртов и альдегидов. Поскольку в структурном отношении липиды, представляющие собой гетерогенную группу органических соединений, так или иначе связаны с длинноцепочечными карбоновыми кислотами, в настоящем разделе целесообразно привести более подробную характеристику жирных кислот как непременных компонентов липидов.
Высшие жирные кислоты – это алифатические карбоновые кислоты, получаемые в основном из природных жиров и масел и состоящие из не менее чем 10 атомов углерода. Практически все встречающиеся в естественных условиях жирные кислоты содержат четное число атомов углерода (чаще всего 16 или 18, образующих неразветвленную цепь (см. приложение 1)). Длинная углеводородная цепь, составляющая «хвост» молекулы жирной кислоты, может быть полностью насыщена, т.е. содержать только одинарные связи, или ненасыщена, т.е. содержать одну или несколько двойных связей. Как правило, ненасыщенные жирные кислоты встречаются в животных и растительных тканях в два раза чаще, чем насыщенные. В большинстве случаев у ненасыщенных жирных кислот двойная связь расположена между 9-м и 10-м атомами углерода и обозначается Δ9. Дополнительные двойные связи обычно расположены между Δ9‑двойной связью и метильным концом цепи (см. приложение 1). Двойные связи практически во всех природных жирных кислотах находятся в цис-конфигурации, что приводит к сильному изгибу алифатической цепи (рис. 10.5).
Рис. 10.5. Пространственные модели: А – пальмитиновой кислоты (С16, насыщенная); Б – олеиновой кислоты (С18, ненасыщенная). Двойная связь в цис-конфигурации обусловливает изгиб углеводородной цепи олеиновой кислоты
Жирные кислоты с несколькими двойными связями (например, арахидоновая кислота, содержащая четыре двойные связи) имеют несколько изгибов цепи, и их молекулы обладают большей жесткостью, чем молекулы насыщенных жирных кислот; последние благодаря свободному вращению вокруг одинарных связей характеризуются большей гибкостью и большей длиной. При температуре тела насыщенные жирные кислоты в ряду С12–С24 находятся в твердом воскообразном состоянии, в то время как ненасыщенные жирные кислоты представляют собой жидкости. В таблице 10.1 показано, как длина углеводородной цепи и степень ненасыщенности жирных кислот влияют на их температуру плавления.
Ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав жиров, подразделяют в соответствии со степенью их ненасыщенности следующим образом:
1) мононенасыщенные (моноеновые), имеющие одну двойную связь;
2) полиненасыщенные (полиеновые), имеющие две, три и четыре двойные связи;
Таблица 10.1
Физические свойства некоторых природных жирных кислот
| Тривиальное название | Число атомов углерода | Температура плавления, °С |
| Насыщенные жирные кислоты | ||
| Лауриновая | 44,2 | |
| Миристиновая | 53,9 | |
| Пальмитиновая | 63,1 | |
| Стеариновая | 69,6 | |
| Арахиновая | 76,5 | |
| Лигноцериновая | 86,0 | |
| Ненасыщенные жирные кислоты | ||
| Пальмитолеиновая (1 дв. связь) | -0,5 | |
| Олеиновая (1 дв. связь) | 13,4 | |
| Линолевая (2 дв. связи) | -5,0 | |
| Линоленовая (3 дв. связи) | -11,0 | |
| Арахидоновая (4 дв. связи) | -49,5 |
3) эйкозаноиды (приставка эйкоза- означает присутствие 20 атомов углерода в жирной кислоте). Эти соединения образуются из эйкозаполиеновых жирных кислот и подразделяются на простаноиды и лейкотриены. Простаноиды включают простагландины, простациклины и тромбоксаны. Простаноиды образуются путем циклизации определенного участка в центре углеводородной цепи у эйкозаполиеновых жирных кислот (например, арахидоновой) с образованием циклопентанового кольца. К кольцу могут быть присоединены различные группы (кетогруппы, гидроксигруппы и другие). Тромбоксаны также содержат атомы кислорода в своем циклопентановом кольце. При образовании лейкотриенов циклизации не происходит, а соответствующие ферменты осуществляют встраивание кислорода по двойным связям жирных кислот.
4) другие ненасыщенные жирные кислоты представлены различными соединениями, содержащими, в частности, гидроксильные или циклические группы.
Свободные жирные кислоты нерастворимы в воде, однако, поскольку эти соединения являются, по существу, карбоновыми кислотами, имеющими карбоксильную группу, они способны образовывать соли с моно- и дивалентными катионами металлов – такими, как K+, Na+, Ca2+, Mg2+.
Натриевые и калиевые соли жирных кислот получили название мыл. Мыла представляют собой амфипатические вещества: их ионизованная карбоксильная группа формирует полярную «головку», а алифатическая углеводородная цепь – неполярный, т.е. гидрофобный «хвост».
Амфипатические соединения являются поверхностно-активными веществами (ПАВ), проявляющими свойства детергентов (или эмульгаторов). Данные соединения способны эмульгировать нерастворимые в воде масла и жиры, встраивая свои алифатические «хвосты» в капли жира, при этом полярные «головки» мыла взаимодействуют с водой. Этим самым мыла переводят гидрофобные частицы в растворимое в воде состояние, что позволяет легко удалить их с загрязненной поверхности. Наиболее широкое распространение получили твердые (натриевые соли жирных кислот) и жидкие (калиевые соли жирных кислот) мыла благодаря тому, что именно натриевые и калиевые соли жирных кислот хорошо растворимы в воде. Описывая физико-химические свойства мыл, следует отметить, что при попытке их растворения в жесткой (например, водопроводной) воде они теряют свою растворимость и выпадают в виде белых хлопьев. При этом их моющая способность резко снижается. Утрата детергентных свойств мыл в жесткой воде объясняется присутствием в ней ионов Ca2+ и Mg2+ в значительной концентрации, что приводит к образованию нерастворимых в воде кальциевых и магниевых солей жирных кислот.
Свободные жирные кислоты легко образуются при взаимодействии мыла с сильными неорганическими кислотами (например, соляной). Уравнение данной реакции выглядит следующим образом:
R-COONa + HCl ® R-COOH + NaCl.
Жиры (триацилглицеролы)
Триацилглицеролы – наиболее простые и широко распространенные липиды, содержащие жирные кислоты. Другие часто употребляемые названия этих липидов – жиры, нейтральные жиры или триглицериды. Такие липиды состоят из трехатомного спирта глицерола и присоединенных к нему сложноэфирными связями одного, двух или трех остатков длинноцепочечных жирных кислот. При этом образуются так называемые моно-, ди- и триацилглицеролы соответственно. Количество жирных кислот, а также их качественный состав (число атомов углерода в цепи, наличие или отсутствие двойных связей, их количество) зависят от вида жира. Большинство природных жиров – смешанные триацилглицеролы (рис. 10.6).
Рис. 10.6. Структура триацилглицерола
Физические свойства жиров организма в основном зависят от длины углеродных цепей составляющих их жирных кислот, а также степени их ненасыщенности. Так, точка плавления жирных кислот с четным числом атомов углерода повышается с ростом длины цепи и падает при увеличении степени ненасыщенности (см. табл. 10.1). Таким образом, чем больше в составе триацилглицерола ненасыщенных жирных кислот, тем ближе его состояние к жидкому при нормальных условиях (например, если все три жирные кислоты насыщенные, то жир имеет твердую консистенцию, если все ненасыщенные – жидкую, называемую маслом).
Для выявления содержания в данном жире ненасыщенных жирных кислот, а также степени их ненасыщенности можно использовать бромную воду. Обесцвечивание бромной воды свидетельствует о присутствии в растворе соединений, содержащих двойные связи. Это обусловлено протеканием процесса бромирования данных соединений по их двойным связям и расходованием брома.
Жиры относятся к нейтральным липидам, т.е. не несут заряда и обладают резко выраженными гидрофобными свойствами. Поэтому жиры не растворимы в воде и плохо растворимы в других полярных растворителях (в зависимости от степени полярности). Данные соединения хорошо растворяются в неполярных органических растворителях – таких, как эфиры, хлороформ, керосин и др.
Триацилглицеролы способны образовывать довольно устойчивые эмульсии при их растворении в растворе мыла. Эмульгирующие свойства мыл, лежащие в основе их применения в качестве моющих средств, были подробнее рассмотрены выше. Эмульгирование жира может также происходить в растворе щелочи, т.к. свободные жирные кислоты, всегда присутствующие в небольшом количестве в любом жире, реагируют со щелочью, образуют мыла и эмульгируют жир. Механизм эмульгирования жиров в растворе соды сходен с механизмом эмульгирования в растворе щелочи. В растворах белков образуются растворимые в воде липопротеиновые конгломераты, в составе которых гидрофильные участки белков экспонированы наружу, а гидрофобные участки и жиры располагаются внутри и не контактируют с водой. Наконец, одними из наиболее мощных эмульгаторов жиров являются желчные кислоты и их соли, которые имеют в составе как гидрофобные, так и гидрофильные участки и поэтому способны действовать как сильные ионные детергенты.
Важным свойством жиров и масел является их способность гидролизоваться под действием щелочей с высвобождением глицерола и свободных солей жирных кислот (мыл). Эта реакция получила название омыления (рис. 10.7).
Рис. 10.7. Уравнение реакции омыления триацилглицеролов
Омыление триацилглицеролов раствором щелочи протекает в течение нескольких часов из-за нерастворимости жира в воде и значительно быстрее (примерно четверть часа) – в водно-спиртовом растворе, т.к. жир растворяется в горячем спирте и этим достигается лучшее взаимодействие молекул жира и щелочи.
Химические свойства липидов
Качественные реакции на жиры
Акролеиновая проба. Данная проба проводится для обнаружения в липидах глицерола. При нагревании глицерола в присутствии водоотнимающих средств (гидросульфата калия, борной кислоты либо сульфата магния) происходит образование непредельного акрилового альдегида – акролеина:
СН2ОН–СНОН–СН2ОН ® СН2=СН–СНО + 2Н2О.
Акролеин имеет специфический раздражающий запах. Обнаружить присутствие в выделяемых парах можно также по реакции с аммиачным раствором оксида серебра. Имеющий альдегидную группу акролеин способен восстанавливать Ag2O до металлического серебра, вызывая почернение участка фильтровальной бумаги, смоченной в аммиачном растворе оксида серебра. Механизм данной реакции аналогичен механизму реакции «серебряного зеркала», характерной для восстанавливающих моносахаридов. Точно так же качественной реакцией на альдегидную группу акролеина может служить реакция с фуксинсернистой кислотой. В этом случае фильтровальная бумага, смоченная в растворе фуксинсернистой кислоты и выдержаная в парах акролеина, приобретает ярко-розовую окраску.
Липиды, не содержащие глицерола (воска, стероиды и др.), акролеиновой пробы не дают. В частности, при проведении этой реакции с воском образование акролеина не происходит.
Пробы с осмиевой кислотой и c суданом III. Осмиевая кислота и судан III являются специфическими красителями на жиры и часто используются для окрашивания образцов в микроскопии. В случае осмиевой кислоты жир приобретает черную окраску, а краситель судан III окрашивает его в различные оттенки красного цвета.
Количественное определение жирных кислот
c диэтилдитиокарбаматом
При взаимодействии жирных кислот с медь-триэтаноламиновым реактивом (уксусная кислота: нитрат меди: триэтаноламин в соотношении 1:10:9) образуются медные соли жирных кислот. В свою очередь диэтилдитиокарбамат (ДЭДТК) [(C2H5)2NCSSNa], специфически взаимодействуя с медью в составе полученных медных солей жирных кислот, обеспечивает количественно пропорциональное окрашивание раствора.
Качественные реакции на холестерол
Рассматриваемые в данной работе качественные реакции на холестерол (реакции Шиффа, Сальковского и Либермана-Бурхарда) сходны друг с другом по природе химических превращений. Под действием серной кислоты происходят дегидратация и окисление холестерола. В результате этого две молекулы холестерола, потерявшие по одной молекуле воды, соединяются между собой по третьему атому углерода, образуя вещества, соответствующие суммарным формулам С54Н86 и С54Н88 (в зависимости от положения двойных связей). Эти непредельные углеводороды с сопряженными двойными связями дают различные производные с серной кислотой и уксусным ангидридом. Указанные реакции характерны не только для холестерола, но и для других стеролов, а также для холевой кислоты.
Реакция Шиффа. При наслаивании концентрированной серной кислоты на раствор холестерола на границе раздела двух жидкостей появляется оранжевое кольцо, которое при стоянии переходит в красное.
Реакция Сальковского. При легком встряхивании полученной в предыдущем опыте смеси после отслаивания верхний слой жидкости окрашивается в красный цвет, нижний имеет желто-оранжевую окраску с зеленой флуоресценцией (жидкость в проходящем свете прозрачная желто-красная, в отраженном свете кажется мутной с зеленым оттенком).
Реакция Либермана-Бурхарда. При добавлении к раствору холестерола реактива Либермана-Бурхарда (смесь серной и уксусной кислот, а также уксусного ангидрида) вначале появляется красное окрашивание, которое затем переходит в фиолетовое, синее и зеленое. При незначительном содержании холестерола в растворе сразу появляется зеленое окрашивание.
Количественное определение общего холестерола
Метод Илька. Принцип метода основан на реакции Либермана-Бурхарда: холестерол в присутствии уксусного ангидрида и смеси уксусной и серной кислот дает зеленое окрашивание с интенсивностью, пропорциональной концентрации холестерола.
Методы определения желчных кислот
Желчные кислоты имеют полностью насыщенный стерановый скелет и боковую цепь, состоящую из 5 атомов углерода. Известны 4 желчные кислоты, из них две первичные и две вторичные. Первичные желчные кислоты синтезируются в печени из продуктов распада холестерина и поступают в двенадцатиперстную кишку. К первичным желчным кислотам относятся: холевая кислота, содержащая гидроксильные группы в 3-м, 7-м и 12-м положениях, и хенодезоксихолевая кислота, содержащая только две гидроксильные группы в 3-м и 7‑м положениях.
Вторичные желчные кислоты синтезируются в кишечнике из первичных желчных кислот под действием ферментов микрофлоры. К ним относятся: дезоксихолевая кислота, имеющая гидроксильные группы в 3-м и 12-м положениях, и литохолевая, содержащая гидроксильную группу только в 3-м положении.
В желчи содержатся, главным образом, конъюгаты желчных кислот с глицином и таурином в виде, например, гликохолевой и таурохолевой кислот.
Амфифильная природа желчных кислот и их солей обусловливает их поверхностно-активные свойства и участие в переваривании жиров.
Качественные реакции на желчные кислоты
Проба Гея –основана на том, что желчные кислоты являются поверхностно-активными веществами, снижающими поверхностное натяжение раствора. В связи с этим порошок серы, помещенный на поверхность раствора желчных кислот, тонет, в то время как в воде порошок серы не тонет.
Проба Петенкоффера – основана на образовании окрашенного продукта при взаимодействии желчных кислот и оксиметилфурфурола. Последний образуется из сахарозы при действии концентрированной серной кислоты. При наличии в растворе желчных кислот он приобретает красно-фиолетовую окраску.
Контрольные вопросы
1. Биологические функции липидов.
2. Общие свойства, классификация и номенклатура липидов.
3. Жирные кислоты. Насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты.
4. Строение и свойства нейтральных жиров. Воска.
5. Методы оценки физико-химических свойств жиров.
6. Качественные реакции на жиры.
7. Количественное определение жиров.
8. Строение и свойства стероидов. Холестерол и его эфиры.
9. Желчные кислоты. Их биологическая роль.
10. Качественные реакции на холестерол, желчные кислоты.
11. Количественное определение холестерола.
Литература
1. Страйер Л. Биохимия, т. 1, 2, 3. – М.: Мир, 1985.
2. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. – М.: Просвещение, 1987.
3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека, т. 1, 2. – М.: Мир, 1993.
4. Горячковский А.М. Справочное пособие по клинической биохимии. – Одесса: ОКФА, 1994.
5. Евстигнеева Р.П., Серебренникова Г.А., Звонкова Е.Н., Филиппович Е.И., Митрофанова Т.К., Мягкова Г.И., Скляр Ю.Е. Химия биологически активных природных соединений / Под ред. Преображенского Н.А. – М.: Химия, 1976.
6. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. – М.: Высшая школа, 1998.
7. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000.
8. Зайчик А.Щ., Чурилов Л.П. Основы патохимии. – СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2000.
9. Чиркин А.А. Практикум по биохимии. – Мн.: Новое знание, 2002.
Ход работы
Тема: Нейтральные жиры
СВОЙСТВА ЖИРОВ
w Определение непредельности высших жирных кислот
1. В пробирку помещают 10 капель бромной воды.
2. Затем добавляют 3 капли масла и смесь встряхивают.
3. Отмечают изменение окраски бромной воды. Объясняют наблюдаемое явление и делают выводы о присутствии непредельных жирных кислот в составе данного масла.
w Растворение жиров
1. В 4 пробирки помещают по 3 капли масла (жира).
2. Затем в первую пробирку добавляют 2 мл керосина (бензина), во вторую – 2 мл хлороформа, в третью – 2 мл эфира, в четвертую – 2 мл спирта.
3. Отмечают различия в растворимости данного масла (жира) в приведенных растворителях. Объясняют получаемые результаты и делают выводы.
w Эмульгирование жиров
1. В 6 пробирок помещают по 3 капли масла (жира) и 2 мл воды.
2. Затем в первую пробирку добавляют 5 капель раствора белка, во вторую – 5 капель NaOH, в третью – 5 капель раствора NaHCO3 (сода), в четвертую – 5 капель раствора мыла, в пятую – 5 капель раствора желчи, а шестую пробирку оставляют в качестве контроля.
3. Содержимое пробирок перемешивают. (Если в эксперименте используется твердый жир, пробирки предварительно инкубируют в горячей водяной бане для его плавления.)
4. Отмечают поведение данного масла (жира) в каждой из пробирок. Объясняют полученные результаты и делают выводы.
w Омыление (щелочной гидролиз) жиров
1. Взвешивают 2 г жира (или масла), вносят в пробирку и добавляют к нему 6 мл 15%-ного спиртового раствора NaOH.
2. Омыление проводят при температуре около 30 °С в течение 10‑12 минут.
3. Для определения окончания реакции омыления несколько капель гидролизата вливают в небольшое количество горячей дистиллированной воды. при закончившемся омылении гидролизат полностью растворяется в воде.
4. По окончании омыления смесь выливают в фарфоровую чашку, добавляют 20–30 мл воды.
5. Затем путем нагревания содержимого чашки на водяной бане удаляют спирт, при этом объем раствора уменьшается приблизительно наполовину.
6. После упаривания раствор доводят до объема 20 мл дистиллированной водой. Результирующий раствор используется для получения свободных жирных кислот.
w Получение свободных жирных кислот
1. К 3 мл раствора, полученного в предыдущем опыте, добавляют 10%-ную HCl до кислой реакции.
2. Наблюдают образование белой мути, постепенно всплывающей в виде жировых капель на поверхности водного слоя (свободные жирные кислоты).
3. Добавляют 5 мл эфира, отверстие пробирки закрывают пробкой и встряхивают. Жировые капли растворяются, водный слой становится прозрачным.
4. осторожно отсасывают эфирный слой пипеткой и переносят несколько капель на предметное стекло. После испарения эфира на стекле остается налет.
КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ЖИРЫ
w Акролеиновая проба на жиры
1. В пробирку вносят 3 капли масла (жира) и добавляют пятикратное количество безводного гидросульфата калия (либо безводного сульфата магния, либо борной кислоты).
2. Пробирку осторожно нагревают до появления белых густых паров.
3. Отмечают (осторожно!) резкий раздражающий запах акролеина.
4. В пары вносят кусочек фильтровальной бумаги, смоченный аммиачным раствором оксида серебра.
5. Отмечают изменение окраски фильтровальной бумаги. Объясняют полученный результат.
6. Затем в пары вносят кусочек фильтровальной бумаги, смоченный фуксинсернистой кислотой.
7. Отмечают изменение окраски фильтровальной бумаги. Объясняют полученный результат.
8. Такой же эксперимент (пункты 1–7) проводят с кусочком воска.
9. Делают выводы о строении используемого в данном опыте жира и воска.
w Проба с осмиевой кислотой
1. На предметное стекло наносят 1 каплю масла.
2. В нее добавляют 1 каплю 1%-ного раствора осмиевой кислоты.
3. Отмечают изменение окраски. Объясняют полученный результат и делают выводы.
w Проба с суданом III
1. На предметное стекло наносят 1 каплю масла.
2. В нее добавляют 1 каплю раствора судана III.
3. Отмечают изменение окраски. Объясняют полученный результат и делают выводы.
Тема: Стероиды
КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ХОЛЕСТЕРОЛ
w Реакция Шиффа
1. В пробирку наливают 10 капель 1%-ного хлороформного раствора холестерола.
2. Далее добавляют равный объем концентрированной серной кислоты (осторожно, по стенке пробирки).
3. Отмечают появление окрашенного кольца на границе слоев, а также изменение окраски со временем. Объясняют наблюдаемое явление и делают выводы.
w Реакция Сальковского
1. После проведения пробы Шиффа жидкость осторожно встряхивают, перемешивая содержимое пробирки.
2. Отмечают окрашивание различных частей раствора (после отстаивания), а также изменение окраски со временем. Объясняют полученный результат и делают выводы.
w Реакция Либермана-Бурхарда
1. В пробирку наливают 10 капель 1%-ного раствора холестерола в хлороформе.
2. Затем добавляют 5 капель реактива Либермана-Бурхарда.
3. Содержимое пробирки осторожно вст
|
|
|
