Методы выделения чистой культуры

Для выделения чистой культуры применяют методы, ос­нованные на:

1) механическом разобщении бактериальных клеток;

2) предварительной обработке исследуемого материала физическими или химическими факторами, оказыва­ющими избирательное антибактериальное действие;

3) избирательном подавлении размножения сопутствую­щей микрофлоры физическими или химическими факторами во время инкубации посевов;

4) способности некоторых бактерий быстро размножать­ся в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопробы).

Основные среды.

Пептонный бульон. Выпускается в сухом виде; состав (г/л): триптический гидролизат кильки; натрия хлорид — 4,95.

Питательный агар. Состав (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей — 12,0; агар — 12,5; натрия хлорид 5,5; рН 7,3+0,1.

основные сложные среды —кровяные, сывороточные. Их готовят путем добавления к питательному ашру 5—10 % дефибринированной крови или сыворотки крови либо 25 % асцитической жидкости. Для приготовления ЖИДКОЙ среды такие же количества сыворотки или асцитической жидкости добавляют к питательному бульону. «Агар Мюллера-Хинтон (основная плотная питательная среда для определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков): на 1 л дистиллированной воды мясного настоя (из говядины), 17,5 г гидролизата казеина, Уф г крахмала, 17 г агар-агара.

Элективные питательные среды. Пептонная вода 1 %, рй 8,0. Избирательная для холерного вибриона, который размножается быстро, опережая рост других микроорганизмов. Щелочная реакция среды не препятствует росту возбудителя холеры Vibrio cholerae, но тормозит рост других микроорганиз­мов.

Щелочной агар (плотная среда): питательный агар, рН 7,8, аналогично предыдущей среде элективен для V.cholerae. - Среда Леффлера. Смесь 1 части лошадиной сыворотки и 3 частей сахарного бульона, скошенная в пробирках при нагревании в аппарате Коха, элективна для возбудителя диф­терии Corynebacterium diphtheriae.

Желточно-солевой агар (ЖСА). Содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8—10 %), которые не препятствуют размножению стафилококков, что обеспечивает селективность среды для данных микроорганизмов. Среда позволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие лецитиназу, от стафилококков, не выделяющих этот фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний лецитиназоположительных видов (фермент расщепляет лецитин куриного желтка, который вносится в рас­плавленный и остуженный до 45 "С питательный солевой агар).

Дифференциально-диагностические среды.

Среды Гисса. К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и индика­тор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NaOH), разливают по пробиркам. В пробирки помещают поплавок (трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении угле­водов. Среда при рН 7,2—7,4 бесцветна. При разложении уг­леводов она приобретает красный цвет.

Среда Ресселя. Применяется при изучении биохими­ческих свойств энтеробактерий (шигелл, сальмонелл). Содер­жит питательный агар, лактозу, глюкозу и индикатор бромти-моловый синий. Приготавливают в пробирках по 6—8 мл в виде столбика со скошенной поверхностью. Цвет незасеянной среды травянисто-зеленый. Посев делают штрихом по скошен­ной поверхности и уколом в глубину столбика. Микроорганиз­мы, ферментирующие глюкозу до кислоты, вызывают измене­ние окраски столбика среды из первоначальной травянисто-зе­леной в желтую; скошенная поверхность при этом приобретает синий цвет. Лактозоположительные микроорганизмы (£. со/0 изменяют цвет столбика и скошенной части среды в желтый. Микроорганизмы, образующие щелочь, изменяют цвет среды в синий. Газообразование отмечается в толще столбика среды.

Среда Эндо. Выпускается в виде порошка, который со­стоит из высушенного питательного агара с 1 % лактозы и индикатора — основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или бледно-ро­зовая. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блес­ком; лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные ко­лонии.

Среда Плоскирева (бактоагар Ж). Выпускается в сухом виде и содержит питательный агар с лактозой, брилли­антовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными со­лями и индикатором (нейтральный красный). Эта среда является не только дифференциально-диагностической, но и селек­тивной, так как подавляет рост многих микроорганизмов (ки­шечная палочка и др.) и способствует лучшему росту некото­рых патогенных бактерий (возбудители брюшного тифа, пара-тифов, дизентерии). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные — красные.

Висмут-сульфит агар. Выпускается в сухом виде; со­держит триптический гидролизат кильки, глюкозу, неоргани­ческие соли, бриллиантовый зеленый, агар. Среда предназна­чена для выделения сальмонелл. Дифференцирующие свойства среды основаны на-способности микроорганизмов продуциро­вать H2S, который вступает в реакцию с цитратом висмута и образует соединение черного цвета — сульфит висмута. Среда резко угнетает рост сопутствующей микрофлоры за счет инги-бирующего действия бриллиантового зеленого и сульфита на­трия.

Техника посевов и пересевов культур микроорганизмов. Уни­версальным инструментом для производства посевов является бактериологическая петля (металлическая многоразовая или пластмассовая одноразовая). Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериологическую иглу, а для по­севов на чашки Петри — металлические, стеклянные или плас­тиковые шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. • Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплав­ких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их по­мещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

Все манипуляции с микробами осуществляют с помощью стерильных инструментов вблизи пламени горелки. Металли­ческую бактериологическую петлю перед использованием, по­сле каждой манипуляции и по окончании работы стерилизуют путем прокаливания в пламени горелки.

Культивирование микробов осуществляют посевом их на питательные среды с последующей инкубацией в оптимальных условиях температуры, влажности, газового состава атмосферы и т.д. С этой целью материал, содержащий микроорганизмы (материал от больного, из чистой культуры, из изолированной колонии и т.д.), помещают (засевают) в жидкие или на плотные среды. В последнем случае посев может быть произведен как на поверхность, так и в глубину агара уколом. Предварительно посуду (пробирку, чашки Петри и др.) надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследова­ния или название культуры).

В зависимости от техники посева и концентрации микробов в посевном материале бактерии на поверхности плотной питательной среды могут давать равно­мерный сплошной рост — бактериальный газон, "сливной рост" (возникает при помещении большого количества микро­организмов на ограниченный участок поверхности агара) или образовывать изолированные колонии.

Получение изолированных колоний. Образование изолированных колоний достигается путем механического ра­зобщения микробов при посеве. С этой целью материал, взя­тый петлей, наносят на поверхность агара параллельными штрихами, чем достигается последовательное уменьшение кон­центрации бактерий вплоть до единичных клеток. Для сниже­ния концентрации бактерий можно также зигзагообразными движениями густо нанести материал на небольшой участок агара в верхней части чашки Петри, после чего петлю стери­лизуют, а материал распределяют параллельными штрихами по остальной части среды.

Другой способ состоит в приготовлении суспензии с малой концентрацией бактерий. Одну каплю такой суспензии нано­сят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают стерильным шпателем в среду, равномер­но распределяя материал по всей ее поверхности.

Получение бактериального газона. Посевы "га­зоном" производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питатель­ного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, ос­тужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают мате­риал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Получение сливного роста. В пробирку со скошен­ным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным дви­жением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив.