Изучение условий проведения фотометрической реакции таурина с нингидрином

 

В разделе 2.3.1 дано описание методики фотометрического определения таурина в условиях проведения нингидриновой реакции с образованием фиолетового (синего) Руэмана [18-20], установленных в работе после предварительно проведенных исследований. Были апробированы некоторые рекомендации для определения капролактама [20] и аминокислот [18].

Поиск условий проведения фотометрической реакции с нингидрином с целью определения низких концентраций таурина заключался в следующем:

· изучение влияния рН буферного раствора;

· изучение влияния температуры и режима нагревания;

· изучение влияния добавок гидриндантина (ГД), органических растворителей;

· изучение влияния порядка введения реактивов на величину устойчивого аналитического сигнала.

Попытка получения окрашенного в сине-фиолетовый цвет продукта реакции нингидрина (НГ) с таурином по методике [18] (разд. 2.2.4 – пропись I) не удалась. Причиной этого может быть, с одной стороны, неполное соблюдение условий, связанных с невозможностью использования NaCN в составе буферного раствора, и отсутствие рекомендованного изопропанола. С другой стороны, что вероятнее, указанное значение рН буфера (5,3-5,4) не подходит для проведения реакции (образуется продукт желто-оранжевого цвета).

Поэтому возникла необходимость поиска других условий, в частности, с использованием рекомендаций работы [20]. При проведении эксперимента варьировались: соотношение компонентов, порядок их введения, рН буферного раствора, концентрация таурина. Измерение оптической плотности окрашенного продукта проводилось при 570 нм. Результаты представлены в таблице 3.1.

 

Таблица 3.1.

Влияние условий проведения реакции таурина с нингидрином на получение окрашенного продукта

№		Условия опыта		стаурина, моль/л		Результаты (А570)
11.		4 мл раствора таурина; 2 мл раствора реагентов Ι; 3 мл этилцеллозольва; 1 мл буферного раствора рН 6		6,4·10-4		Окраска отсутствует.
22.		4 мл раствора таурина; 1 мл буферного раствора рН 6; 2 мл раствора реагентов Ι; после охлаждения пробы 3 мл этилцеллозольва		6,4·10-4		Окраска отсутствует.
33.		1 мл раствора таурина; 2 мл раствора реагентов Ι; 3 мл этилцеллозольва; 1 мл буферного раствора рН 6,55		6,4·10-4		Окраска отсутствует.
44.		2 мл раствора реагентов Ι; 1 мл буферного раствора рН 6; 1 мл раствора таурина; 3 мл Н2O; 3 мл этилцеллозольва		3,2·10-3		Окраска отсутствует.
55.		2 мл раствора реагентов Ι; 1 мл буферного раствора рН 6,55; 1 мл раствора таурина; 3 мл Н2O; 3 мл этилцеллозольва		3,2·10-3		Окраска отсутствует.
66.		3 мл раствора реагентов ΙΙ; 2,5 мл буферного раствора рН 6,55; 2 мл раствора таурина; 2,5 мл Н2O (окрашенный продукт был разбавлен в 3 раза)		3,2·10-3		Продукт фиолетового цвета (0,972); окраска нестабильна.
77.		3 мл раствора реагентов ΙΙ; 2,5 мл фосфатного буферного раствора рН 6,86; 2 мл раствора таурина; 2,5 мл Н2O		3,2·10-3		Окраска отсутствует.
88.		3 мл раствора реагентов ΙΙ (готовился без ГД); 2,5 мл буферного раствора рН 6,55; 2 мл раствора таурина; 2,5 мл Н2O (окрашенный продукт был разбавлен в 3 раза)		3,2·10-3		Продукт фиолетового цвета (0,718); окраска нестабильна.
99.		2,6 мл раствора реагентов ΙΙ; 0,9 мл буферного раствора рН 6,55; 0,5 мл раствора таурина; 6 мл Н2O		3,2·10-3		Окраска не стабильна (0,125)
110.		2,6 мл раствора реагентов ΙΙ (готовился с избытком ГД (в 2 раза)); 0,9 мл буферного раствора рН 6,55; 0,5 мл раствора таурина; 6 мл Н2O		3,2·10-3		Окраска стабильна в течение 15 мин. (0,224)
111.		3,5 мл раствора реагентов ΙΙ (готовился с избытком ГД (в 2 раза)); 0,9 мл буферного раствора рН 6,55; 0,5 мл раствора таурина; 5,1 мл Н2O		3,2·10-3		Окраска стабильна в течение 15 мин. (0,206)
	112.		2,6 мл раствора реагентов ΙΙ (готовился с избытком ГД (в 2 раза)); 1,5 мл буферного раствора рН 6,55; 0,5 мл раствора таурина; 5,4 мл Н2O		3,2·10-3		Окраска стабильна и более интенсивна (0,443)
	113.		3 мл раствора реагентов ΙΙ (готовился с избытком ГД (в 2 раза)); 2 мл буферного раствора рН 6,55; 0,5 мл раствора таурина; 4,5 мл Н2O		3,2·10-3		Окраска стабильна до 20 мин. и более интенсивна (0,684)
	114.		3 мл раствора реагентов ΙΙ (готовился с избытком ГД (в 2 раза)); 2 мл буферного раствора рН 6,55; 5 мл раствора таурина. Нагревание в закрытой колбе 20 мин. Градуировочная зависимость в интервале концентраций от 0,1·10-4 моль/л до 2,5·10-4 моль/л: y = (0,054  0,002) + (5090  500)x		6,4·10-4		Окраска стабильна до 20 мин. Раствор интенсивно окрашен. (1,573)

Примечания к таблице: Раствор реагентов Ι: 0,2 г НГ и 0,03 г ГД растворяли в 10 мл этилцеллозольва. Раствор реагентов ΙΙ по методике [20]: 0,2 г НГ и 0,03 г ГД растворяли в 7,5 мл этилцеллозольва.

 

При проведении фотометрической реакции необходимо было получить устойчивый аналитический сигнал в течение времени, достаточного для анализа, высокий и постоянный выход окрашенного продукта, обеспечивающий определение концентрации таурина менее 1·10-5 моль/л (для исследования десорбции). Наиболее подходящими условиями для получения красителя оказались результаты опытов с 2- кратным избытком ГД по отношению к рекомендуемому в методике [20] и увеличение количества буферного раствора практически в 2 раза (п.14 табл.4.1). В этом случае аналитический сигнал получается и при низких концентрациях таурина, а оптическая плотность стабильна в течение 20 мин (рис. 4.1). Для получения более стабильной окраски рекомендуют [18] проводить реакцию в присутствии солей меди или кадмия. В данном эксперименте в качестве стабилизатора использовался CuSO4 с концентрацией 10-3 моль/л (1 мл). Однако на устойчивость окраски добавка соли меди практически не повлияла, с течением времени она также убывает.

Таким образом, показано, что ГД увеличивает интенсивность окраски продукта реакции, повышает ее стабильность (рис. 3.1).

 

Рис. 3.1. Влияние ГД на получение и стабильность красителя

 

Однако введение ГД приводит к появлению плохо воспроизводимой окраски холостого опыта красных оттенков, которая налагается на окраску продукта, как это можно видеть из спектров поглощения (рис. 3.2а).

 

Рис. 3.2. Спектры поглощения продукта нингидриновой реакции.

Концентрация таурина 6,4·10-5 моль/л. Условия реакции:

а – в присутствии гидриндантина по п.14 (табл. 4.1) (разбавление в 3 раза);

б – без гидриндантина при рН 6,2 с добавкой этанола.

 

Анализируя полученные результаты, приведенные в табл. 3.1, можно сделать следующие обобщения:

1. Раствор реагентов Ι - “не работает”, т.к. все реакции с этой смесью не дали окрашенного продукта.

2. ГД повышает устойчивость окраски во времени; без ГД интенсивность окраски раствора ниже и устойчивость снижается.

3. Важна также последовательность добавления веществ для получения окрашенного продукта и дальнейшего анализа, а именно: раствор реагентов, буферный раствор, раствор таурина.

4. Необходимо использовать ацетатный буферный раствор с рН 6,50-6,55, в отличие от 5,3-5,4 по методике [18].

Таким образом, методика анализа с введением ГД имеет следующие недостатки: плохую воспроизводимость результатов, высокий аналитический сигнал холостого опыта (рис. 4.2а) и ограниченную стабильность продукта. В связи с этим был необходим поиск иных условий проведения реакции таурина с нингидрином без введения ГД.

Исследование влияния рН в интервале 5,1 – 6,5, создаваемом ацетатным буфером, показало, что синий продукт образуется при рН 6,5 и без ГД, в отличие от капролактама [20]. То есть для проведения нингидриновой реакции с таурином необходимы более высокие значения рН, чем указанные в работе [18]. При этом время нагревания при температуре 80єС пришлось увеличить до 60 минут, вместо 22 мин [20].

Согласно литературным данным на стабильность и интенсивность окраски продукта оказывают влияние добавки спиртов в реакционную смесь. Вводить спирт для стабилизации окраски рекомендуется или после реакции (изопропиловый, амиловый) или во время реакции (этиловый вместе с изобутиловым) [18]. Введение в смесь реагентов этилового спирта и проведение реакции при температуре 100єС в течение 10 минут позволило получить окрашенный продукт сине-фиолетового цвета (рис. 3.2б), устойчивый в течение суток. Порядок введения реактивов не влияет на аналитический сигнал. При этом аналитический сигнал холостого опыта существенно ниже, чем в присутствии ГД (рис. 3.2).

При использовании такого смешанного растворителя установлено, что наибольшая величина полезного аналитического сигнала получается при рН 6,2 и приготовлении раствора нингидрина в этилцеллозольве с добавлением спирта в соотношении 1:1. При рН 6,55 в присутствии этанола практически в 2 раза увеличивается оптическая плотность холостого опыта, что нежелательно. На образование окрашенного продукта влияет режим нагревания. Для лучшей повторяемости результатов в присутствии этанола, как показали наблюдения, нагревание следует проводить в вертикально установленных на кипящую водяную баню открытых колбах одинакового калибра. При этом получается окрашенный продукт, сходимость измерений оптической плотности которого (А570) на уровне 0,1 (при концентрации таурина 1,3·10-5 моль/л) при п = 6¸7 характеризуется Sr не превышающим 3%.

Таким образом, использование спирта позволило в определенной степени решить поставленные задачи. Установлены наиболее приемлемые условия проведения нингидриновой реакции с таурином: растворитель нингидрина – этилцеллозольв, стабилизатор окраски – этиловый спирт (их соотношение в смеси реагентов 1:1); буферный раствор с рН 6,2; температура реакции 100єС; время нагревания 10 минут. Нагревание следует проводить в тонкостенных открытых колбах с большим свободным объемом (100 мл при объеме реакционной смеси 10 мл). Методические детали выполнения анализа в отработанных условиях приведены в разд. 2.3.1.

Предыдущая123456789Следующая

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: