 |
Структура молекулы тайтина и его функции
|
|
|
|
Тайтин (= коннектин, титин) – гигантский эластичный белок скелетных и сердечных мышц млекопитающих (Maruyama et al., 1977; Wang et al., 1979) с молекулярным весом более 3 МДа (Labeit & Kolmerer, 1995). Он был открыт независимо двумя группами исследователей методом ДСН-гель-электрофореза (Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981). Тайтин является третьим по количеству (после актина и миозина) компонентом саркомера поперечно-полосатых мышц позвоночных. Молекулы тайтина длиной около 1 мкм и шириной 3–4 нм (Trinick et al., 1984; Itoh et al., 1986; Nave et al., 1989; Soteriou et al., 1993; Suzuki et al., 1994; Houmeida et al., 1995; Tskhovrebova & Trinick, 1997) перекрывают половину саркомера от М-линии до Z-линии (рис. 1), простираясь через I- и А-диски саркомера, формируя третью филаментную систему в миофибриллах (Fürst et al., 1988). NH2-концы молекулы тайтина из смежных саркомеров перекрываются в Z-линии, а СООН-концы перекрываются в М-линии. На каждую половину саркомера приходится по шесть молекул тайтина, которые объединены в А-диске саркомера (Trinick 1981; Liversage et al., 2001) и, предположительно, разделяются на пары или на индивидуальные молекулы в I-диске саркомера (Funatsu et al., 1993).
Исследования последних лет показали, что этот гигантский полипептид имеет различное строение в разных зонах саркомера, что вносит свой вклад в их архитектуру и функционирование. Бóльшая часть (~90%) молекулы тайтина состоит из повторяющихся иммуноглобулин-С2-подобных (IgС2) и фибронектин-3-подобных (FnIII) доменов (Labeit & Kolmerer, 1995) с β-складчатой структурой, содержащих около ста аминокислотных остатков (Improta et al., 1996; Muhle-Goll et al., 1998) (рис. 2). Кроме этих доменов тайтин содержит уникальные последовательности, расположенные по всей длине его молекулы: киназный домен вблизи М-линии саркомера; два участка связывания с кальпаиновой протеазой (р94) в I-диске и М-линии саркомера, а также эластичные N2B, N2A и PEVK элементы в I-диске саркомера. В концевых областях молекулы тайтина расположены фосфорилируемые участки.
|
|
|
1.2 Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка
Предположение о присутствии белков немиозиновой природы в структуре толстых, или миозин-содержащих нитей на основании электронно-микроскопических и рентгеновских исследований высказывались давно (Draper & Hodge 1949; Franzini-Armstrong & Porter 1964; Pepe 1967; Hanson et al., 1971), однако до начала 70-х годов природа этих белков была неизвестна. С-белок, Х-белок и Н-белок были обнаружены с помощью ДСН-гель-электрофореза как минорные примеси в препаратах миозина скелетных мышц кролика (Starr & Offer, 1971). В настоящее время эти белки охарактеризованы, и их количество в саркомере составляет около 5% от массы миозина.
С-белок впервые был выделен из скелетных мышц кролика (Offer et al., 1973). Его количество составляет около 2% от массы миофибрилл и около 4% от массы толстой нити.
Показана способность сердечного С-белка фосфорилироваться разными протеинкиназами в условиях in vivo и in vitro (Jeacocre & England, 1980; Hartzell & Titus, 1982; Hartzell & Glass, 1984; Hartzell, 1985; Lim et al., 1985; Gautel et al., 1995; Mohamed et al., 1998). Молекулярный вес С-белка скелетных мышц по данным ДСН-гель-электрофореза 135 кДа (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983), а по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующих этот белок, составляет 128.1 кДа (Weber et al., 1993). Аминокислотный состав белка характеризуется довольно высоким содержанием пролина, что коррелирует с низким содержанием α-спирали в его молекуле. Методом седиментации показано, что С-белок связывается с высоким сродством с миозином (Callaway & Bechtel, 1981; Yamamoto & Moos, 1983). Электронно-микроскопические исследования подтвердили это связывание для С-белка: он декорирует реконструируемые миозиновые нити и паракристаллы легкого меромиозина (ЛММ) in vitro (Moos et al., 1975; Starr & Offer, 1978; Safer & Pepe, 1980; Фрейдина и др., 1980; Подлубная, 1981; Podlubnaya et al., 1990). Показана способность С-белка связываться с актином (Moos et al., 1976; Moos et al., 1978; Moos, 1981; Фрейдина и др., 1980) и тайтином (Koretz et al., 1993; Soteriou et al., 1993; Fürst et al., 1992; Freiburg & Gautel, 1996). При снижении ионной силы ниже физиологических значений (μ ≤ 0.1).
|
|
|
Х-белок содержится в грубых препаратах С-белка, выделенного из миозина хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе (Starr & Offer 1982). Был разработан метод разделения Х- и С-белков с помощью колоночной хроматографии на гидроксиапатите (Starr & Offer 1982; Starr et al., 1979). Молекула Х-белка представляет собой гибкую ниточку длиной около 30–35 нм и диаметром 3–4 нм (Bennett et al., 1985). Молекулярный вес Х-белка скелетных мышц кролика по данным ДСН-гель-электрофореза составляют и 145–152 кДа (Yamamoto & Moos 1983; Starr & Offer 1983), а по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующего этот белок, составляют 126.5 кДа (Weber et al., 1993).
Аминокислотный состав характеризуется высоким содержанием пролина, что соответствует низкому (4%) содержанию α-спирали.
Н-белок выделен из скелетных мышц кролика, точнее – из грубых препаратов С-белка, хроматографией на гидроксиапатите (Starr & Offer, 1982; 1983). Он составляет 0.3–0.4% от миофибриллярной массы. Молекула Н-белка содержит одну полипептидную цепь с молекулярным весом по данным ДСН-гель-электрофореза ~ 69–74 кДа (Starr & Offer, 1983), а по данным другого метода ~ 86 кДа (Vaughan et al., 1993). Молекулярный вес Н-белка скелетных мышц цыпленка и человека по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующего этот белок, составляет 58.4 кДа и 51.9 кДа, соответственно (Vaughan et al., 1993). Аминокислотный состав Н-белка сходен с аминокислотным составом С-белка, но отличается от последнего более высоким содержанием пролина и аланина и более низким содержанием аспарагиновой кислоты, валина и лизина (Yamamoto, 1984). Молекула Н-белка содержит около 4% α-спирали (Starr & Offer, 1983). Н-белок взаимодействует с миозином и с актином (Starr & Offer, 1983).
Белки семейства тайтина могут участвовать в сборке толстых нитей и стабилизации их структуры. Известно, что С-белок, также как и тайтин (Wang & Wright, 1988), появляется в мышечной клетке на ранних стадиях миофибриллогенеза (Bahler et al., 1985). Имеются также данные о влиянии тайтина, С-белка и Х-белка на формирование миозиновых нитей in vitro (Koretz, 1979; Miyahara & Noda, 1980; Koretz et al., 1982; Вихлянцев 2005). Вероятно, что С-белок (вместе с тайтином) участвует в сборке и стабилизации структуры толстых нитей. Исследования in vitro показали, что Н-белок влияет на связывание С-белка с миозином (Yamamoto, 1984). Показано связывание С-белка и тайтина с актином в условиях in vitro. Предполагается, что физиологическое значение этого связывания в саркомерах скелетных мышц заключается в регуляции актин-миозинового взаимодействия. В экспериментах in vitro показано, что тайтин и С-белок активируют АТФазу актомиозина. Это влияние может быть обусловлено как модифицирующим действием С-белка и тайтина на миозиновый мостик, так и прямым их взаимодействием с актином (Moos et al., 1978, 1980; Moos, 1981; Muhle-Goll et all., 2001; Moolman-Smook et al., 2002; Squire et al., 2003). Х-белок и Н-белок также могут быть вовлечены в процесс мышечного сокращения, ингибируя АТФ-азную активность актомиозина (Yamamoto, 1984, Вихлянцев, 2005). В поддержку предположения о регуляторной роли С-белка в сократительной активности являются данные о фосфорилировании С-белка сердечной мышцы. В ранних исследованиях было показано, что уровень фосфорилирования С-белка в интактном сердце коррелирует со скоростью релаксации мышцы (Hartzell & Glass, 1984). In vitro фосфорилирование сердечного С-белка приводило к снижению его активирующего эффекта на АТФазу АМ (Hartzell, 1985). На основе полученных данных автором было сделано предположение, что С-белок участвует в механизме расслабления сердечной мышцы. Однако результаты дальнейших исследований показали, что фосфорилирование С-белка модулирует процесс сокращения сердечной мышцы, увеличивая доступность миозиновых головок к актину (Weisberg & Winegrad, 1996, 1998; Kunst et al., 2000; McClellan et al., 2001; Kulikovskaya et al., 2003; McClellan et al., 2004; Flashman et al., 2004). Действительно, согласно последним данным фосфорилирование сердечного С-белка приводит к усилению сократительной активности мышцы (Stelzer et al., 2006).
|
|
|
1.3. Белки семейства тайтина в норме, при адаптации и патологии
|
|
|
Структурно-функциональные свойства белков семейства тайтина в норме описаны выше. Эти белки являются важными компонентами сократительного аппарата мышечной клетки, участвуя в построении и стабилизации структуры саркомера. Влияние белков семейства тайтина на АТФазу актомиозина указывает на их важную регуляторную функцию в норме.
Поведение белков семейства тайтина при адаптации рассматривается на примере гибернации (зимней спячки). Показано, что у гибернирующего животного уменьшается площадь поперечного сечения мышечных волокон. Изменения структурно-функциональных свойств миозин-содержащих нитей скелетных мышц вносят вклад в подавление двигательной активности животного при зимней спячке (Лукоянова и др., 1996). В скелетных мышцах гибернирующих животных обнаружено снижение активирующего влияния тайтина и С-белка и увеличение ингибирующего влияния Х-белка на ферментативные и регуляторные свойства миозина (Вихлянцев и др., 2000; 2002).
Поскольку причину развития ДКМП большинство исследователей видит в повреждении сократительных структур миокарда, а условия микрогравитации приводят к "гипогравитационному мышечному синдрому" (Гуровский и др., 1975; Nemirovskaya et al., 2002), становится вполне понятным пристальное внимание исследователей к этим патологическим состояниям. Показано, что пребывание в условиях моделируемой микрогравитации приводит к уменьшению количества тайтина и Х-белка в m. soleus крыс и человека, что, наряду с другими изменениями в мышечном аппарате, будет вносить вклад в развитие "гипогравитационного мышечного синдрома" (Вихлянцев и др., 2006). Увеличение содержания тайтина в миокарде левого желудочка человека при ДКМП приводит к снижению уровня пассивного напряжения одиночных миофибрилл и волокон, что отражается на сократительной функции сердца (Макаренко и др., 2002, Макаренко, 2004).
Данные, полученные при исследовании свойств полифункциональных белков семейства тайтина в норме, при адаптации и заболеваниях дают основание предполагать, что изменения их структурно-функциональных характеристик может вносить вклад в развитие патологических процессов в мышцах. Выяснение роли тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка в патогенезе разных болезней является чрезвычайно актуальной задачей. В данной работе объектом нашего внимания являлись амилоидозы и, в частности, амилоидные свойства этих белков in vitro.
Глава 2. Амилоидозы
Актуальность проблемы
Амилоидозы – болезни, которые характеризуются отложениями нерастворимых фибрилл белка (амилоидных фибрилл) в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков. Амилоидные отложения играют центральную роль в патогенезе болезней, от которых страдают миллионы пациентов (болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Дауна, диабет II типа, наследственная амилоидная полинейропатия, системные амилоидозы, прионные амилоидозы и др.) (Uversky & Fink, 2004). Однако, процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка и ее патологического проявления при болезнях, изучены еще недостаточно.
|
|
|
Амилоидоз широко распространен среди многих представителей животного мира. Описаны первичные (идиопатические), вторичные (приобретенные), наследственные и старческие его формы (Виноградова, 1980). Амилоидные отложения могут достигать килограммов (как, например, фибриллярные скопления лизоцима в печени). Они найдены также в сердечной мышце при кардиомиопатиях, миокардитах и в скелетных мышцах при миозитах (Барсуков и др., 2005). При миокардитах (воспалительное поражение сердечной мышцы) амилоид имеет вид россыпи. Возможно тотальное поражение сердца или только предсердий, только желудочков или клапанов. При кардиопатическом амилоидозе амилоид откладывается в эндо-, мио- и эпикарде. Отложения амилоида в сердце приводят к резкому увеличению его размеров (амилоидная кардиомегалия). Оно становиться очень плотным, миокард приобретает сальный вид ("резиновый миокард"). Миозит с включенными тельцами (амилоидами) сопровождается изнурительными мышечными болями. Амилоидные отложения обнаружены в скелетных мышцах, в миокарде, и по ходу межмышечной соединительной ткани, а также в стенках сосудов и нервах. Мышцы становятся плотными, полупрозрачными (Виноградова, 1980).
Уже сейчас амилоидозы – главная причина смерти после сердечно-сосудистых и раковых заболеваний. Диагностика большинства из них посмертная. Генезис этого заболевания, при котором возможно поражение любых органов и тканей и, следовательно, возникновение разнообразной клинической симптоматики, остается до конца не изученным. Возможно, причиной является спонтанное развитие амилоидоза, или наследственная передача болезни. Патогенез амилоидоза не уточнен, клинические проявления весьма пестрые и не всегда четко очерчены, лечение малоэффективно и редко диагностируется при жизни. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление белковой природы депозитов и их свойств, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами.
|
|
|
