Промышленная технология культивирования штамма-продуцента инсулина.

Создание технологии получения субстанции инсулина человека.

Основные этапы исследований, положенных в основу технологии производства инсулина, включали: 1) создание штамма-продуцента инсулина; 2) создание технологии получения субстанции ГИЧ; 3) масштабирование процесса и создание опытно-промышленного производства активной фармацевтической субстанции (АФС) инсулина; 4) разработка методов контроля качества и создание стандарта качества (фармакопейной статьи предприятия).

Технологический процесс производства субстанции ГИЧ в ИБХ РАН основан на следующей схеме:

1. Получение посевного материала штамма-продуцента (оживление консервированной культуры; выращивание маточной культуры; выращивание инокулята).

2. Биосинтез рекомбинантного белка (РБ) (выращивание продуцента в ферментере (ферментация); получение биомассы (сепарирование); дезинтеграция клеточной суспензии; выделение и отмывка телец включения (центрифугирование)).

3. Выделение и очистка РБ (солюбилизация телец включения и восстановление РБ белка; ренатурация и последующая хроматографическая очистка РБ).

Ферментативное расщепление РБ.

Хроматографическая очистка инсулина.

Получение кристаллов ГИЧ.

Создание штамма-продуцента инсулина человека.

Перед началом исследований по разработке технологии получения инсулина в распоряжении исследователей был созданный в ИБХ РАН штамм-продуцент E.coli JM109pPINS07, для создания которого была использована рекомбинантная плазмидная ДНК pPINS07 с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), кодирующая рекомбинантный белок (РБ), в котором последовательность иммуноглобулин-G-связывающего домена В белка А St. aureus соеди­нена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью про­инсулина человека.

Штамм JM109pPINS07 исходно использовался при разработке процесса получения инсулина. Созданная на его основе технология позволяла получить ГИЧ фармакопейного качества с приемлемым выходом, но продуктивность штамма и эффективность очистки все еще оставалась недостаточно высокой. В ходе многочисленных экспериментов исследователями был создан новый штамм E. coli BL07 – продуцент гибридного полипептида с последовательностью проинсулина человека путем трансформации клеток E. coli BL21 плазмидой pPINS07 с помощью электропорации.

Полученный штамм E. coli BL21/pLP-3-1, названный E.coli BL07 обладал значительными преимуществами перед штаммами-продуцентами использованными ранее. Это, в частности, возрастание внутриклеточного содержания рекомбинантного препроинсулина человека как следствие инактивации в плазмиде некоторых генов, кодирующих бактериальные белки. Кроме того, в клетках нового штамма отсутствовали продукты деградации предшественника инсулина, затрудняющие его очистку.

Разработка технологии культивирования штамма-продуцента инсулина.

Изучение процесса культивирования продуцента позволило разработать технологию, состоящую из ниже описанных стадий.

1.2.1. Приготовление посевного материала.

Эталонную (музейную) культуру штамма-продуцента дважды последовательно высевали на агаризованной питательной среде. Отобранные клоны проверяли на продуктивность РБ методом электрофореза на полиакриламидном геле. Уровень накопления гибридного белка должен быть не менее 30% от суммы всех белков клетки. Далее для выращивания маточной культуры в колбу с жидкой питательной средой вносили несколько типичных колоний рабочей культуры и выдерживали при +37^оС. Готовая маточная культура имела оптическую плотность при длине волны 540 нм, равную 7,5 оптическим единицам (ОЕ); рН 5,1 и типичную морфологию клеток при отсутствии посторонней микрофлоры. Инокулят, получаемый из маточной культуры, имел оптическую плотность при длине волны 540 нм, равную 4,3 ОЕ; рН 6,1 и был использован на стадии биосинтеза.

1.2.2. Биосинтез РБ.

Выращивание штамма-продуцента проводили в биореакторе (ферментере) объемом 200 л, содержащем питательную стерильную среду. В ферментер засевали инокулят и проводили биосинтез при температуре +37^оС, рН 7,0, рО₂ - 55% от насыщения и давлении в аппарате 0,25 атм. Температуру, рН, давление в аппарате поддерживали автоматически. При достижении необходимой оптической плотности культуральной жидкости культуру непрерывно подпитывали раствором глюкозы. В ходе культивирования в ферментер вносили раствор ампициллина и проводили индукцию синтеза рекомбинантного белка изопропил-β-D-тиогалактозидом (ИПТГ). Через 4-5 ч. После добавления индуктора процесс останавливали. Общее время культивирования составляло 12-13 ч.

Съем сырой биомассы с 1 л культуральной жидкости – 55 г, содержание влаги – около 70%, содержание рекомбинантного белка в клетках биомассы – 25-30 %[*].

1.2.3. Получение биомассы.

Культуральную жидкость центрифугировали с помощью проточной центрифуги. Средний съем сырой биомассы – 11 кг, влажность - 72%, содержание РБ в биомассе – 27-30%.

1.2.4. Разрушение клеток и выделение телец включения.

Подготовленную суспензию клеточной биомассы разрушали на проточном дезинтеграторе при повышенном давлении в 600 атм. за 3-4 цикла дезинтеграции. Разрушение клеток контролировали по накоплению растворимого белка, степень разрушения клеток оценивали визуально с помощью микроскопа. Степень разрушения клеток составляла 90-95%. Дезинтегрированную суспензию клеток далее подавали на вращающийся ротор проточной центрифуги. Скорость подачи не более 1 л/мин. Вес влажного осадка телец включения (ТВ), содержащих рекомбинантный белок, составлял около 3 кг (15 г/л КЖ), содержание влаги около 80%, содержание РБ около 50%.

Промышленная технология культивирования штамма-продуцента инсулина.

Масштабирование технологии культивирования штамма-продуцента ГИЧ было осуществлено применительно к аппаратурной схеме цеха промышленной ферментации ОБП ИБХ РАН. В ходе проведения технологических экспериментов был достигнут коэффициент масштабирования от 5 до 10.

Основные отличия производственного процесса от лабораторного следующие:

а) посевной материал (инокулят) выращивался в ферментере, рабочим объемом 200 л (температура +37^оС, рН 7,0, рО₂ - 55% от насыщения, давление в аппарате 0,25 атм), с автоматическим контролем параметров процесса. При достижении необходимой оптической плотности культуральной жидкости, материал передавался в производственный ферментер.

б) Выращивание штамма-продуцента проводилось в производственном ферментере объемом 3000 л. Процесс контролировался автоматизированной системой управления (АСУ ТП) с параметрированием основных характеристик.

в) Стадия сбора клеток и отмывки ТВ осуществляется на промышленном сепараторе непрерывного действия. Стадия разрушения упрощена применением замкнутого контура.

Основные характеристики процесса: съем биомассы с 1000 л - 70 кг (влажность 72%); количество ТВ – 17 кг (влажность 80%); суммарное содержание белка – 2100г; (содержание РБ 86%); продуктивность – 1,8 г РБ с 1 л культуральной жидкости.

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: