Контрольные вопросы. Лекция 30. Создание вакцин. План лекции

Контрольные вопросы

 

1. Важные области использования иммунохимического анализа.

2. Области применения моноклональных антител.

3. Способы супрессии иммунного ответа с помощью иммунобиопрепаратов.

   4. Метод гибридомной технологии.

 

     

Лекция 30

Создание вакцин

Форма проведения лекции: проблемная

     

   План лекции

 

1. Создание вакцин.

 2. Классификация вакцин

 2. 1 Живые вакцины.

 2. 2 Неживые (инактивированные) вакцины.  

 2. 3 Комбинированные вакцины.

3. Сыворотки.

 

1. Вирусы – облигатные (безусловные) внутриклеточные паразиты, чья репликация полностью зависит от процессов синтеза ДНК, РНК белков в клетке хозяина. Репликация вирусов включает несколько этапов:

- адсорбция и проникновение в клетку;

- синтез ранних, неструктурных белков, например, полимераз, нуклеиновых кислот;

- синтез РНК или ДНК;

- синтез конечных структурных белков;

- сборка (созревание) вирусных частиц и их выход из клетки.

     При многих вирусных инфекциях репликация вируса достигает максимума во время появления первых клинических признаков заболевания или даже ранее. Формирование у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам способствует вакцинация. Антитела, вырабатываемые в ответ на введение вакцины в организм, запускают иммунный ответ – вырабатываются антитела, которые при последующей инфекции блокируют пролиферацию патогенного микроорганизма и не позволяют развиться заболеванию.

  Эффект вакцинации был открыт более 200 лет назад (1796 г. ) врачом Эдвардом Дженнером, доказавшим, что человек, перенесший коровью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчив к оспе натуральной. Натуральная оспа – высококонтагиозное (заразное) заболевание, с высокой смертностью, даже, если больной не погибает, у него нередко возникают различные уродства, психические расстройства, слепота. Э. Дженнер публично провел прививку коровьей оспы 8-летнему мальчику Джеймсу Фиппсу, использовав для этого экссудат из пустулы больной коровьей оспой, а затем, через определенное время, дважды инфицировал ребенка гноем из пустулы больного натуральной оспой. Все проявления заболевания ограничились покраснением в месте прививки, исчезнувшим через несколько дней.

Начиная с первой вакцины, созданной Э. Дженнером, большинство человеческих противовирусных вакцин созданы на основе убитых (инактивированных) патогеннных микроорганизмов или живых, но не вирулентных (аттенуированных) штаммов. Этот подход достаточно эффективен и предотвращает распространение многих вирусных инфекций, однако его применение ограничено рядом причин:

- невозможностью культивирования всех патогенных микроорганизмов;

- потенциальной опасностью в работе с патогенными микроорганизмами и вирусами;

- возможностью ревертировать (возвращаться к исходному вирулентному штамму) аттенуированных штаммов (инактивация часто бывает неполной);

- высокой стоимостью производства традиционных вакцин (титр вирусов животных и человека в культуре и скорость их размножения, как правило, невысоки).

Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать новое поколение вакцин более безопасных и эффективных, менее дорогих, не имеющих ограничений в применении. При этом используют разные подходы:

   1. Патогенный микроорганизм модифицируют, делетируя (убирая) гены, ответственные за вирулентность, при этом сохраняется способность штамма вызвать иммунный ответ. Получаются живые вакцины, содержащие непатогенные микроорганизмы, которые не могут ревертировать и становится патогенными.

  2. Гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты (белки) патогенных микроорганизмов, экспрессируют в альтернативном хозяине, например Е. соli, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Такие вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют субъединичными вакцинами. Достоинства субъединичных вакцин состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могут быть причиной нежелательных побочных эффектов в организме-хозяине. Недостатки субъединичных вакцин – очистка специфического белка высока по стоимости; его конформация после выделения может отличаться от той, которую он имеет in situ (то есть в составе вирусного капсида или оболочки), что может повлечь изменение его антигенных свойств.

  3. Клонированные гены, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенного организма, встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают живую безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину. Живые вакцины, как правило, более эффективны, чем неживые или субъединичные.

Одним из новых направлений создания рекомбинантных вакцин является разработка ДНК-вакцин (так называемых генных, полинуклеотидных вакцин, вакцин из нуклеиновых кислот). Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного организма и генетические элементы, которые необходимы для экспрессии этого гена в клетках эукариотов (человека). В качестве продуцентов таких генов используют бактериальные клетки, содержащие рекомбинантные плазмиды с соответствующими генами. После получения достаточной биомассы (количество копий) плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Полученную ДНК-вакцину вводят парентерально, при этом большая ее часть поступает в межклеточное пространство, после чего включается в клетки.

Противогерпетические вакцины. Вирус простого вируса (HSV. Herpes simplex virus) вызывает инфекционное заболевание генерализованного или местного характера (характеризуется преимущественно поражением кожи, слизистых оболочек, нервной системы и хроническим рецидивирующим течением, тяжелым поражением глаз, энцефалитом и т. д. ). Кроме того, он является онкогенным, поэтому вакцинация убитым или аттенуированным вирусом сопряжена с определенным риском развития рака. Для защиты от HSV- инфекции используют неонкогенную субъединичную вакцину.

Для создания любой субъединичной вакцины прежде всего идентифицируют те компоненты патогенного микроорганизма, которые индуцируют выработку антител. В случае HSV-типа таким компонентом является гликопротеин Д-оболочки (gД). В ответ на введение этого гликопротеина мышам у них вырабатываются антитела, нейтрализующие интактный HSV. Ген gД   HSV-1 был изолирован, клонирован в одном из экспрессирующих векторов в клетках млекопитающих и введен в яйцеклетки китайского хомячка (СНО), в которых, в отличие от Е. соli, происходит гликолизирование чужеродных белков. Полноразмерный ген gД   кодирует белок, в норме связывающийся с мембраной клетки млекопитающего. Затем модифицированным геном трансформировали СНО-клетки, которые гликолизировали белковый продукт и секретировали его во внешнюю среду, так как он не мог встраиваться в клеточную мембрану. Антитела, вырабатываемые в ответ на введение модифицированного белка gД, эффективны в отношении вируса простого герпеса.

Противосальмонеллезные вакцины.  Разные штаммы Salmonella вызывают острые кишечные инфекции, постнатальную (послеродовую) инфекцию, брюшной тиф, пищевую токсикоинфекцию. Для профилактики всех этих заболеваний у овец, КРС, цыплят и человека эффективные пероральные вакцины созданы методом двойной делеции.

Такой способ получения непатогенных штаммов, пригодных для создания на их основе живых вакцин, состоит в удалении из генома патогенных бактерий хромосомных областей, отвечающих за независимые жизненноважные функции. Лучше делетировать по крайней мере две такие области, так как вероятность их одновременного восстановления очень мала. Штамм с двойной делецией обладает ограниченной пролиферативной способностью и сниженной патогенностью, но обеспечивает выработку иммунного ответа. Штаммы Salmonella с двойной делецией вызывают легкую форму инфекции и обладают в 100 тыс. раз меньшей вирулентностью.

   Рассмотрим более подробно вакцины и сыворотки, а также биотехнологические методы их получения. Как уже отмечалось, вакцины относятся к группе активных специфических препаратов и применяются с целью профилактики или лечения. Вакцинация способствует формированию у реципиента иммунитета к пато­генным микроорганизмам и тем самым защищает его от инфекции. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакци­ны в организме человека или животного вырабатываются антите­ла к патогенному микроорганизму, которые при последующей инфекции приводят к его инактивации (нейтрализации или гибе­ли), блокируют его пролиферацию и не позволяют развиться за­болеванию. Эффект вакцинации открыл в 1796 г. врач Э. Дженнер. Он доказал экспериментально, что человек, перенесший коро­вью оспу (не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота), становится невосприимчивым к оспе натуральной.

   2. Вакцина — сложный иммунобиотехнологический препарат, в состав которого входят:

· действующий компонент, представляющий специфические
антигены (живые ослабленные микроорганизмы, убитые микроб­
ные клетки или вирусные частицы, извлеченные из микроорга­
низма антигенные структуры, продукты жизнедеятельности мик­
роорганизмов — токсины как вторичные метаболиты);

· консервант, который определяет стабильность вакцины при ее хранении и не допускает размножения случайно попавшей в препарат микрофлоры (мертиолят 1: 10000, формалин и другие антимикробные препараты);

· «стабилизатор, предохраняющий антиген от разрушения и про­длевающий тем самым срок годности вакцины (сахарозо-агар-желатина и др. );

· адъювант, повышающий иммуногенность антигена, т. е. его
свойство вызывать иммунный ответ (полимерный носитель, ми­
неральный сорбент, липиды и эмульгаторы).

    В зависимости от природы, характера и способа получения вак­цины классифицируются (по А. А. Воробьеву) на живые (аттенуированные, дивергентные, рекомбинированные (векторные)); нежи­вые или инактивированные — корпускулярные (цельноклеточные, цельновирионные, субклеточные, субвирионные) и молекулярные (биосинтетические природные и генно-инженерные, химически синтезированные); комбинированные (из живых и неживых вакцин).

   Можно классифицировать вакцины по виду лекарственной формы на инъекционные (жидкие), пероральные (таблетки, кап­сулы, драже), ингаляционные (аэрозоли).

    Живые вакцины. Половина из всех применяемых в настоящее время вакцин относится к живым вакцинам разного происхожде­ния. Это вакцины как бактерийного происхождения, применяемые для профилактики сибирской язвы, чумы, туберкулеза, так и ви­русного происхождения, применяемые для профилактики оспы, кори, гриппа, краснухи, полиомиелита и других заболеваний.

 Аттенуированные вакцины представляют собой препараты, по­лученные из естественных штаммов микроорганизмов с ослаб­ленной для человека вирулентностью (аттенуированных). Аттенуацию (ослабление) проводят путем длительного воздействия антигенов на штамм химических (мутагены) и физических (темпе­ратура, радиация) факторов или путем длительных пассажей на невосприимчивых животных или других биообъектах (эмбрионы птиц, культуры клеток).

 В качестве живых вакцин можно использовать дивергентные штаммы, т. е. непатогенные для человека микробы, имеющие об­щие протективные антигены с патогенными для человека возбу­дителями инфекционных болезней. Классическим примером ди­вергентных живых вакцин является вакцина против натуральной оспы человека, в которой используется непатогенный для чело­века вирус оспы коров. К дивергентным вакцинам также относит­ся БЦЖ-вакцина, в которой используются родственные в анти­генном отношении микобактерии бычьего типа.

  Существует четыре основных стадии получения живых бакте­риальных вакцин:

· выращивание чистых ослабленных культур на жидкой пита­тельной среде в ферментере вместимостью 1 — 2 м³;

· стабилизация;

· стандартизация;

· лиофильное высушивание.

  Рекомбинантные вакцины также относятся к живым вакцинам. В качестве примера можно привести получение рекомбинантной вакцины гепатита В. Как известно, вирус гепатита В не размножа­ется in vitro (в искусственных условиях). Для получения вакцины гепатита В выделенный ген этого вируса вставляют в дрожжевую клетку или в клетку Е. coli. Затем уже промышленным способом эту культуру выращивают в ферментере на обогащенных пита­тельных средах в аэробных условиях, получая значительные коли­чества рекомбинантного белка, содержащего антиген вируса ге­патита В. Введение такой вакцины приводит к образованию анти­тел против гепатита В и создает иммунную защиту организма че­ловека от этого тяжелого заболевания.

       3. Неживые (инактивированные) вакцины. Инактивированные кор­пускулярные вакцины в качестве действующего начала включают убитые химическим или физическим методом культуры патоген­ных бактерий или вирусов (цельно клеточные, цельновирионные вакцины) или же извлеченные из патогенных микро­бов (иногда вакцинных штаммов) комплексы, содержащие про­тективные антигены (субклеточные, субвирионные вак­цины). Для инактивации бактерий и вирусов применяют формаль­дегид, спирт, фенол или температурное воздействие, ультрафио­летовое облучение, ионизирующую радиацию. Для выделения из бактерий и вирусов антигенных комплексов (гликопротеинов, бел­ков) применяют трихлоруксусную кислоту, фенол, ферменты, ультрацентрифугирование и т. д. Получают инактивированные вак­цины путем выращивания на искусственных питательных средах патогенных бактерий или вирусов, которые затем подвергают инактивации или разрушению (в случае необходимости) и выделе­нию антигенных комплексов. Далее проводят очистку и конструи­рование в виде жидкого или лиофильно высушенного препарата, в который обязательно добавляют консервант, иногда — адъюванты.

    В молекулярных вакцинах антиген находится в молекулярной фор­ме или же в виде фрагментов его молекул, определяющих специ­фичность антигенности, т. е. в виде эпитопов, детерминант. Протективный антиген в виде молекул можно получить биологическим син­тезом в процессе культивирования природных патогенных микро­бов, например токсинных бактерий дифтерии, столбняка, ботулиз­ма и др. Синтезируемый этими бактериями токсин в молекулярной форме превращают затем в анатоксин, т. е. нетоксичные молекулы, сохраняющие специфическую антигенность и иммуногенность. Так­же антиген в молекулярной форме, особенно его детерминанты, можно получить химическим синтезом. Этим способом уже синтези­рованы детерминанты многих бактерий и вирусов, в том числе ВИЧ. Однако химический синтез антигенов более трудоемок и имеет огра­ниченные возможности по сравнению с биосинтезом.

    Молекулы антигенов или их эпитопы сами по себе обладают низкой иммуногенностью, что, по-видимому, связано с деструк­цией их в организме ферментами, а также недостаточно актив­ным процессом их адгезии иммунокомпетентными клетками, из-за относительно низкой молекулярной массы антигенов. В связи с этим ведутся поиски повышения иммуногенности молекулярных антигенов путем искусственного укрупнения их молекул, т. е. соз­дания комплекса, состоящего из антигена или его детерминанты, а также полимерного носителя и адъюванта. Часто носитель со­вмещает в себе роль адъюванта. Вакцины, созданные на таком принципе, получили название синтетических, например, вакцина против гриппа на полиоксидонии.

    4. Комбинированные вакцины. Как следует из названия, они ком­бинируются из отдельных вакцин, превращаясь при этом в поли­вакцины, которые способны иммунизировать сразу от несколь­ких инфекций. В качестве примера можно назвать поливакцину АКДС, содержащую дифтерийный и столбнячный анатоксины, а также коклюшные корпускулярные антигены. Эта вакцина, как известно, широко применяется в детской практике.

     5. Сыворотки. К группе препаратов для образования пассивно­го иммунитета (специфической иммуностимуляции) относят сы­воротки, которые содержат поликлональные антитела против инфекционных агентов и микробных токсинов. При введении сыворотки больному его организм получает уже готовые анти­тела. Получают сыворотки путем иммунизации домашних животных (ослов, лошадей). Забор крови у этих животных производят в период максимального содержания антител, однако для этого необ­ходимо постоянно контролировать кровь по такому показателю, как титр антител, что представляет определенные технические трудности. Из крови животных выделяют плазму, затем из нее удаляют фибрин и получают сыворотку.

    Приготовленные таким способом сывороточные препараты ха­рактеризуются относительно низкой активностью и существен­ным количеством примесей. Сыворотки можно получать также из культивируемых на искусственной питательной среде животных клеток. Однако главной проблемой в этом случае является обеспе­чение стабильного роста животных клеток вследствие их генети­ческой нестабильности, непостоянства генетических экспрессии и старения.

   Основные области применения сывороток:

· профилактика и лечение инфекционных заболеваний;

· в случае отравления ядами микробов или животных — при столбняке, ботулизме, дифтерии;

· при укусах змей — для инактивации экзотоксинов в ядах коб­ры, гадюки и др.;

· для диагностических целей (создание разных диагностических наборов, например в тестах на определение беременности).

⇐ Предыдущая21222324252627282930Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: