Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Культуральные системы животных клеток




Различают 3 основных типа культур животных клеток: первичные культуры, получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого пересева; диплоидные культуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие до 50 пересевов диплоидный набор хромосом, которые затем трансформируются в постоянные (перевиваемые) гетероплоидные культуры, существующие вне организма десятки лет.

Кроме того, культуры тканей могут подразделяться по виду животного, от которого они происходят; по типу ткани-источника; по состоянию ткани на момент извлечения (нормальные, опухолевые), по способу выращивания (монослойные, суспензионные, на микроносителях и т. п.).

Главным фактором при выборе ткани или линии клеток для дальнейшего исследования является природа процесса, который будет изучаться на этих клетках.

Как правило, культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с культурами из соответствующих взрослых тканей, но несмотря на ряд практических преимуществ, необходимо помнить, что эти клетки по некоторым параметрам отличаются от взрослых клеток.

Нормальные ткани, как правило, дают начало культурам с ограниченным временем жизни, тогда как культуры клеток, полученных из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долгое время.

 

Первичные культуры

Клетки полученные от животного и поддерживаемые в культуре, называют первичными до тех пор, пока они не будут пассированы (субкультивированы), т. е. до первого пересева. Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются малым пролиферативным пулом, но в них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены и четко обнаруживается экспрессия ряда свойств, присущих данной ткани. Однако первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro.

Первичные культуры клеток получают путем стерильного удаления фрагмента ткани и его механической или ферментативной (0,01-0,05 – 0,25% трипсин, 200-2000 ед/мл коллагеназа) дезагрегации. В случае механической дезагрегации фрагмент ткани измельчают до кусочков размером около 1 мм, которые прикрепляются к субстрату благодаря собственной адгезивности, поверхности субстрата или сгустку плазмы. Ферментативная дезагрегация дает более высокий выход клеток, хотя метод является селективным, поскольку не все клетки переживают диссоциацию. На практике наиболее успешное получение первичных клеток из многих тканей связано с использованием коллагеназы, приводящим к снижению размера экспланта до небольшого кластера клеток, который прикрепляется к субстрату и распластывается.

Культуры первичных клеток легко получить из многих тканей. Какое-то время эти клетки экспоненциально размножаются, но затем примерно через 6 месяцев скорость роста культуры снижается, а через 10 месяцев клетки деградируют и погибают. Это наблюдается примерно после 20-50 генераций (в зависимости от возраста тканей-источников первичных клеток – из эмбриональной – 50, из взрослой – 20). На ранних стадиях клетки остаются эуплоидными, т. е. обладают правильным диплоидным набором хромосом, а позднее они становятся анеуплоидными. В некоторых случаях отдельные из этих клеток выживают и продолжают размножаться, что приводит к установлению клеточного штамма. Частоту таких трансформаций можно увеличить, обработав клетки мутагенами или некоторыми вирусами.

При успешном установлении культуры первичные клетки начинают размножаться и их необходимо периодически пересевать (субкультивировать). Субкультивирование обеспечивает возможность продления существования культуры (получение линии клеток), возможность клонирования, исследования и сохранения клеток, а также получения более однородных популяций. Главным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.

 

Постоянные культуры

После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет (ограниченная линия клеток), либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. Различия в свойствах этих клеток и большой период времени, предшествующий их появлению (иногда несколько месяцев), позволяет предположить мутационную природу появления клеток постоянной культуры (стволовые клетки). Нельзя исключить и возможность предсуществования «бессмертных» клеток, особенно в культурах, полученных из опухолей.

Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшение размера клеток, снижение их адгезивности, округление, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения), по увеличению скорости роста (время удвоения клеток снижается в 1,5-3 раза), по снижению зависимости от сыворотки и возможности поддержания в более простых средах, по снижению зависимости от субстрата и, следовательно, их способности к росту в суспензии; по увеличению гетероплоидности и анеуплоидности, а также по увеличению опухолеродности. Однако, нормальные клетки, спонтанно трансформируясь в постоянную линию, не становятся при этом злокачественными (несмотря на некоторые черты сходства).

Таким образом, постоянные клеточные линии имеют определенные преимущества: высокая скорость роста, возможность достижения более высокой плотности и, следовательно, более высокого выхода биомассы; возможность использования более дешевых сред; способность к суспензионному росту. Но также они имеют и недостатки – повышенная хромосомная нестабильность, отклонение от фенотипа донора, утрата специфических маркеров.

Необходимо отметить, что в литературе не имеется твердой точки зрения на употребление терминов «линия клеток» и «штамм клеток», в связи с чем многие авторы рассматривают их как взаимозаменяемые. Другие исследователи определяют штамм клеток как популяцию клеток, полученную из первичной культуры путем пересева, а под линией клеток понимают клеточную популяцию, полученную из первичной культуры и выращиваемую неопределенно долгое время in vitro.

 

Типы культуральных систем

Непроточные культуры. Обычный тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. Эти системы пригодны для культивирования клеток как в монослое, так и в суспензии. По мере роста клеток в среде культивирования происходит исчерпание питательных веществ и накопление метаболитов – следовательно, среда должна постоянно меняться, что, в свою очередь, приводит к изменению клеточного метаболизма (физиологической дифференцировке). Системы непроточных культур характеризуются в той или иной степени накоплением отходов и непостоянством внешних условий.

Способы увеличения продолжительности жизни культур:

а) прерывистый – часть культуры заменяется равным объемом свежей среды;

б) постоянный – объем культуры постоянно увеличивается с низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются;

в) перфузионный – постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной бесклеточной среды.

Проточные культуры. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Это единственная система, в которой все клетки гомогенны и сохраняют гомогенность в течение длительно периода, что имеет очень важное значение в физиологических исследованиях. Однако использование таких культур для получения клеточных продуктов невыгодно с экономической точки зрения. Системы, пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

 

Монослойные культуры

Требования к поверхности субстрата. Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату (рис. 8) – к другим клеткам либо к стеклу (алюмоборосиликатное стекло, чаще модифицированное), пластику (полистирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и другие при условии правильной обработки этих полимеров – пластиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клетки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу – качественная нержавеющая сталь или титан.

 

Рис. 8. Прикрепление клетки к поверхности субстрата

 

Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культуральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхностной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеинами (наиболее изученным из которых является фибронектин, присутствующий в сыворотке и других физиологических жидкостях), а также присутствие двухвалентных катионов кальция и магния. Суммарный отрицательный заряд поверхности субстрата (например, за счет образования отрицательно заряженных карбоксильных групп) может достигаться предварительным воздействием химическими (окисляющие агенты) и физическими факторами (высоковольтный разряд, облучение УФ), что облегчает электростатическое прикрепление клеток. Поверхность культурального сосуда может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление клеток. К природным субстратам, на которых растут клетки, относятся коллаген и желатин. Для этих целей использую коммерческие препараты коллагена для культуры тканей (например, «Витроген 100»), что позволяет избежать утомительной процедуры получения коллагена из крысиных хвостов.

Культуральная посуда. Монослойное культивирование осуществляют во флаконах (флаконы Ру – самые большие стационарные флаконы, поверхностью до 200 кв. см) или пробирках для культуры тканей, обеспечивающих поверхность роста 5-200 кв. см.

Рост клеток в монослое. В случае монослойных культур необходимо проводить систематические пассажи клеток, используя для этого культуры предыдущего рассева или музейные клетки, сохранившиеся в условиях консервации. Полноценная популяция может быть получена только от генерации, состоящей из жизнеспособных клеток. Поэтому просмотр и оценка качества монослоя имеют решающее значение при выборе культур для пересева.

Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Когда две клетки приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфические движения клеточной мембраны. Первичные клетки, следовательно, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений. Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюдается также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии, но если их не пересеять, они погибают. Из сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способностью снимать контактное торможение.

Снижение распластывания клеток при достижении полного монослоя, а также ошаривание и прекращение роста клеток при их откреплении от подложки легли в основу представлений о тесной связи распластывания нетрансформированных клеток с их ростом.

Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки, трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности. Считается, что эти клетки утрачивают зависящую от плотности регуляцию. Трансформированные клетки способны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не наступает смена среды, то клетки быстро погибают.

Одним из факторов, лимитирующим рост клеток, является истощение в среде необходимых питательных компонентов. Следовательно, для получения высокой плотности клеток необходима периодическая замена питательной среды, а это может приводить к постоянному изменению состава среды, омывающей клетки, что весьма нежелательно.

Процесс подготовки клеточного монослоя к отделению от стекла и формированию суспензии (обработка клеток в монослое 0,02% раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1% трипсином и 0,01% ЭДТА) происходит при комнатной температуре в течение 5-10 минут в зависимости от типа культуры и ее индивидуального состояния. Как только клеточный монослой достаточно разрыхляется и начинает отделяться от стекла, раствор фермента сливают, а в культуральную посуду заливают определенное количество ростовой среды. Этой средой тщательно смывают клетки со стенки сосуда и легким пипетированием способствуют образованию гомогенной взвеси. Полученную взвесь после подсчета числа клеток разводят ростовой средой до посевной дозы и используют при новых пересевах.

Монослойные культуры имеют ряд преимуществ, являющихся предпосылками их широкого использования:

1. выделение секретируемого продукта многими клетками осуществляется эффективнее в случае их прикрепления к субстрату;

2. возможность быстрой и легкой замены питательной среды; возможность сопоставления времени и количества среды с периодом роста клеток или временем наработки продукта;

3. обеспечение наибольшей гибкости исследований, поскольку в монослой могут быть введены любые типы клеток;

4. достижение искусственно высокой плотности клеток с использованием перфузионной техники;

5. возможность использования одной и той же аппаратуры с разным отношением клетки-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.

 

Однако при использовании монослойных культут выявляются и недостатки:

1. сложность масштабирования;

2. отсутствие информативности визуального анализа;

3. трудности с определением и поддержанием таких параметров, как кислотность и содержание О2 и обеспечением гомогенности культуры клеток;

4. необходимость значительных пространств.

 

Суспензионные культуры

Для наращивания клеточной массы удобнее использовать не монослойные, а суспензионные культуры. Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют. Но если некоторые клетки культивировать во вращающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу, предотвращающую агрегацию клеток, можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы. Иногда этого бывает достаточно для получения суспензионной культуры, но обычно требуются специальные сосуды для культивирования суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и магния.

Суспензионные культуры также можно получать путем обработки отобранной для пересева монослойной клеточной культуры 0,02% раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1% трипсином и 0,01% ЭДТА с последующим длительным периодом адаптации, сопровождающимся различными манипуляциями, предотвращающими возврат к монослою.

Суспензионные культуры лучше растут внутри ограниченного диапазона концентраций клеток и в том случае, когда сосуд наполнен средой наполовину. Для обеспечения этих условий необходимо каждый день, или – в случае медленно растущих культур – через день, удалять половину суспензии через боковое горлышко и добавлять равный объем свежей среды.

Некоторые клетки (трансформированные клетки, кроветворные клетки и асцитные опухоли) способны расти как на субстрате, так и в суспензии в зависимости от солевого состава среды культивирования.

Культуры лимфоцитов не обнаруживают тенденции к адгезии к поверхности стекла или пластика и выживают на дне культивационного сосуда под тонким слоем среды.

Суспензионное культивирование первичных и перевиваемых клеточных линий проводят в роллерных установках, где создаются благоприятные для клеток условия постоянного перемешивания жидкой и газовой фаз, общий объем среды при этом снижается вдвое сравнительно со стационарными условиями.

Суспензионное культивирование клеток также можно проводить в ферментерах, предназначенных для суспензионного культивирования микроорганизмов, в которых постоянное перемешивание клеток в среде осуществляется магнитными или механическими мешалками в колбах с высокой скоростью вращения, препятствующей прикрепление клеток к стенкам сосудов.

Суспензионное культивирование дает, по меньшей мере, 2-3-х кратную экономию питательных сред, по сравнению с общепринятым стационарным монослойным культивированием при полном исключении дорогостоящих протеолитических ферментов и буферных растворов. Кроме того, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения получения больших количеств биомассы.

 

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...