Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

как носителей генетической информации 2 глава




Помимо рассмотренного известен еще один тип репликации ДНК - по способу “катящегося кольца”; так реплицируются кольцевые ДНК некоторых фагов, вирусов, митохондрий, плазмид. При этом способе в одной из цепей исходной ДНК (“+”- цепь) происходит разрыв и освободившийся 5¢-конец присоединяется к клеточной мембране. На 3¢-конце “+”-цепи по комплементарной матрице не разорванной “-”-цепи начинается прерывистый синтез дочерней цепи. При этом происходит вращение кольцевой “-”-цепи родительской молекулы, обеспечивающее “сползание” с нее удлиняющейся дочерней цепи. Последняя нарезается на куски, соответствующие по длине исходной молекуле ДНК. Такой способ репликации обусловливает образование многих копий материнской ДНК. Осуществляется он и в случае переноса плазмидной или хромосомной ДНК от донора к реципиенту в процессе конъюгации у бактерий.

Репликация ДНК тесно связана с клеточным делением и играет для него роль биологических часов. У бактерий подавление репликации до ее окончания блокирует возможность их деления. Врастание клеточной мембраны обеспечивает сегрегацию (расхождение) вновь синтезированных молекул между дочерними клетками.

Необходимо иметь в виду, что в живой клетке репликация ДНК существенно зависит от особенностей ее вторичной структуры, связи с клеточной мембраной и различными белками, входящими вместе с ДНК в состав нуклеоидов (эквивалентов ядра) у прокариот и хромосом у эукариот.

 

Молекулярная структура генетического материала эукариот Количественные особенности генома эукариот

 

Главная количественная особенность генетического материала эукариот - наличие избыточной ДНК. Этот факт легко выявляется при анализе отношения числа генов к количеству ДНК в геноме бактерий и млекопитающих. Если средний размер гена бактерий 1500 пар нуклеотидов (п.н.), а длина кольцевой молекулы ДНК хромосомы E.coli и B. subtilis составляет около 1,1 мкм, то в такой хромосоме могут разместиться около 3000 генов. Примерно такое число генов было экспериментально определено у бактерий по числу типов иРНК. Если это число умножить на средний размер гена, то получится, что около 95% генома бактерий состоит из кодирующих (генных) последовательностей. Остальные 5%, по-видимому, заняты регуляторными элементами. Иная картина наблюдается у эукариотических организмов. Например, у человека насчитывают приблизительно 5х104 генов (имеется в виду только суммарная длина кодирующих участков ДНК - экзонов). В то же время, размер генома человека 3х109 п.н. Это означает, что кодирующая часть его генома составляет всего 15-20% от тотальной ДНК. Существует значительное число видов, геном которых в десятки раз больше генома человека, например некоторые рыбы, хвостатые амфибии, лилейные. Избыточная ДНК характерна для всех эукариот. В этой связи необходимо подчеркнуть неоднозначность терминов генотип и геном. Под генотипом следует понимать совокупность генов, имеющих фенотипическое проявление, тогда как понятие генома обозначают количества ДНК, находящееся в гаплоидном наборе хромосом данного вида.

 

Нуклеотидные последовательности в геноме эукариот

 

В конце 60-х годов работами американских ученых Р. Бриттена, Э. Дэвидсона и других была открыта фундаментальная особенность молекулярной структуры генома эукариот - нуклеотидные последовательности разной степени повторяемости. Это открытие было сделано с помощью молекулярно-биологического метода изучения кинетики ренатурации денатурированной ДНК. Различают следующие фракции в геноме эукариот:

1. Уникальные, т.е. последовательности, представленные в одном экземпляре.

2. Промежуточные или среднечастотные повторы - последовательности, повторяющиеся десятки и сотни раз.

3. Высокочастотные повторы, число которых достигает 106 (на геном).

Повторы образуют так называемые семейства, под которыми понимают совокупность последовательностей, полностью или по большей части гомологичных друг другу.

Нередко из-за существенных различий в нуклеотидном составе высокочастотных повторов и остальной ДНК первые образуют при центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия так называемые сателлитные пики, которые имеют большую или меньшую плавучую плотность, чем остальная ДНК. Эта фракция генома представлена небольшим (10-15) числом семейств коротких (5-12 п.н.) повторов, образующих протяженные блоки. Внутри блоков группы повторов отдельных семейств могут чередоваться друг с другом, так что сателлитная ДНК имеет как бы локусную структуру. Гибридизация фракций высокочастотных последовательностей с ДНК непосредственно на препаратах хромосом позволила установить, что эта фракция генома локализована в районах конститутивного гетерохроматина, чаще всего прицентромерного или теломерного. Еще в 30-х годах было показано, что в генетическом отношении эти районы инертны, т.е. не содержат генов. В действительности столь малые последовательности, составляющие сателлитную ДНК, не могут кодировать ничего, кроме олигопептидов. Более того, гетерохроматические районы не транскрибируются. Таким образом, в случае высокочастотных последовательностей ДНК обнаруживается тождество молекулярной организации и генетических свойств хромосомной ДНК эукариот. Следует отметить, что эта фракция у огромного большинства видов занимает не более 10% генома. Близкие виды, например мышь и крыса, имеют различные высокочастотные последовательности, у крысы их нуклеотидный состав не отличается от основной ДНК, тогда как геном мыши содержит четкий АТ-богатый сателлит. Это означает, что высокочастотная ДНК способна к быстрым изменениям в ходе видообразования.

Остальные 90% генома эукариот, его эухроматическая часть, построены по принципу чередования (интерсперсии) уникальных и повторяющихся последовательностей. Условно выделяют два основных типа интерсперсии, получивших название по тем видам, у которых они впервые были описаны:

ü интерсперсия типа “ксенопус” (обнаружена у Xenopus laevis);

ü интерсперсия типа “дрозофила” (впервые описана у D. melanogaster).

Примерно в 50% генома Xenopus laevis уникальные последовательности из 800-1200 п.н. чередуются с повторяющимися, средний размер которых 300 п.н. В остальной части геномов типа “ксенопус” расстояние между соседними повторами значительно превышает 1-2 п.н. Структура генома типа “ксенопус” широко распространена, особенно среди животных. Млекопитающие и человек также относятся к этому типу организации генома. Особенность генома человека и других приматов составляют интерсперсные высокочастотные повторы длиной около 300 п.н. У человека эти повторы содержат сайт, разрезаемый ферментом рестрикции Alu I. Число Alu- подобных повторов в геноме человека достигает 5х105, а по некоторым данным, даже 106.

Alu-подобные последовательности приматов представляют собой частичные дупликации (удвоения) последовательности ВI в геноме грызунов, впервые описанной Г. П. Георгиевым и его сотрудниками.

У D. melanogaster параметры интерсперсии резко отличаются от видов с типом генома “ксенопус”: повторяющиеся последовательности длиной 5600 п.н. чередуются с уникальными, длина которых не менее 13000 п.н. Интересно отметить, что у домашней мухи геном устроен по типу “ксенопус”. Этот факт прямо указывает на то, что в ходе эволюции возможны очень быстрые преобразования характера чередования последовательностей и в эухроматической части генома. Птицы по параметрам интерсперсии занимают промежуточное положение между двумя типами. Как показывают результаты исследования последних лет, многие виды животных и растений по организации генома не могут быть строго отнесены ни к тому, ни к другому типу. Так, в геномах млекопитающих встречаются длинные повторы - в несколько тысяч пар нуклеотидов, в геномах лилейных до 90 % ДНК может быть представлено повторяющимися последовательностями. Например, геном ореха не содержит уникальных последовательностей, превышающих по длине 300 п.н.

Другая особенность повторяющихся последовательностей в геномах эукариот - инвертированные повторы, или палиндромы. В условиях ренатурации они практически мгновенно формируют дуплексные структуры. По существу, палиндромы представляют собой часть промежуточных повторов. Однако некоторые высокочастотные повторы в эухроматической части генома, например члены Alu-семейств, могут встречаться как в прямом, так и в инвертированном положении. Иногда между инвертированными повторами вклиниваются другие последовательности.

 

Гетерогенность ДНК эукариот по нуклеотидному составу

 

У эукариот описаны некоторые особенности структуры ДНК, обусловленные спецификой нуклеотидного состава отдельных последовательностей. Так, встречаются расположенные в одной цепи блоки нуклеотидов, состоящих из нескольких десятков пуринов. Тогда комплементарная часть в другой цепи ДНК будет представлена пиримидинами. Подобные последовательности названы полипуриновыми (полипиримидиновыми) блоками.

Другой вид гетерогенности связан с неравномерностью содержания по длине ДНК пар аденин-тимин (АТ-пары) и гуанин-цитозин (ГЦ-пары). Так, в геноме дрозофилы периодически встречаются последовательности длиной примерно в 100 п. н., на 85 % состоящие из АТ-пар. Поскольку аденин связан с тимином двумя водородными связями, а гуанин с цитозином - тремя, дестабилизирующие ДНК-воздействия будут легче инициировать расплетение дуплексов ДНК с образованием участков частичной денатурации в АТ-богатых областях. Поэтому последние рассматриваются в качестве сайтов инициации элементарных генетических процессов: репликации, транскрипции и рекомбинации.

В заключение отметим, что перечисленные выше особенности молекулярной структуры ДНК эукариот не были предсказаны ни классической генетикой (за исключением, пожалуй, свойств гетерохроматина), ни моделью двойной спирали Уотсона и Крика. Они были раскрыты при исследовании структуры геномов различных эукариотических организмов физико-химическими методами. Функции большинства уникальных и повторяющихся последовательностей пока не определены. Однако вполне вероятно, что сама по себе молекулярная структура ДНК эукариот служит зеркалом генетической регуляции и эволюции высших животных и растений.

 

Число молекул ДНК в хромосомах эукариот

 

Существуют три гипотезы о способах упаковки ДНК в хромосомах эукариот. Согласно первой, по всей длине хромосомы тянется одна единственная непрерывная молекула ДНК (гипотеза однонитчатой, или унинемной, хромосомы). По второй гипотезе, хромосома (хроматида в G2) состоит из двух (или более) субъединиц - полухроматид, субхроматид, которые могут идти параллельно или быть взаимно закрученными. Каждая субхроматида содержит молекулу (молекулы) ДНК. Это гипотеза многонитчатой, или полинемной, в простейшем случае - бинемной хромосомы. Наконец, некоторые авторы полагали, что ДНК в эукариотических хромосомах периодически прерывается связками иной химической природы, например белковой или фосфолипидной. Последнее предположение не нашло экспериментального подтверждения и в настоящее время в основном оставлено.

Что касается моделей многонитчатой хромосомы, то они основаны преимущественно на данных цитологов, наблюдавших “субхроматиды” в живых клетках или после их специальной фиксации. Однако теперь ясно, что с помощью световой и электронной микроскопии строго обосновать эти модели невозможно.

На сегодняшний день по совокупности фактов предпочтение следует отдать гипотезе “одна ДНК: одна хромосома”. В ее пользу свидетельствуют:

ü данные генетики о линейном расположении генов в хромосомах;

ü наличие уникальных нуклеотидных последовательностей в геномах эукариот;

ü распределение 3Н-тимидиновой метки в I и II циклах репликации, полностью соответствующее модели Уотсона и Крика;

ü данные вискозиметрического анализа лизатов клеток культуры ткани дрозофилы с нормальным и перестроенным хромосомными наборами, показывающие, что молекулярная масса самых крупных частиц в лизате (после его депротеинизации) сравнима с молекулярной массой ДНК самых крупных хромосом данного кариотипа;

ü данные по контролируемому растяжению политенных хромосом хиронемуса, указывающие на то, что их разрывы начинаются только тогда, когда растянутая с помощью микроманипулятора хромосома достигает длины упакованной в ней ДНК;

ü данные радиационной цитогенетики, доказывающие, что перестройки хромосом, ранее считавшие субхроматинными, в действительности являются хроматидными аберрациями, имеющими своеобразную конфигурацию при облучении клеток в профазе митоза.

Если верна модель однонитчатой хромосомы, то длина ДНК, заключенной в эукариотических хромосомах, может достигать нескольких сантиметров. Действительно, ауторадиографические наблюдения над меченными 3Н-тимидином молекулами ДНК дрозофилы показывают, что их длина может достигать 1,2 см. В 1-ой хромосоме человека содержится молекула ДНК длиной (по данным разных авторов) от 6 до 8 см. В 1-ой хромосоме Vicia faba в 2,5 раза больше ДНК, чем в 1-й хромосоме человека. Следовательно, ДНК эукариотических хромосом может рассматриваться как гигантский полимер, не имеющий прецедента ни в природе, ни в технике. Мысль о том, что хромосома может представлять собой единую гигантскую молекулу, еще в 30-х годах высказывал Н.К. Кольцов. Значение этого факта состоит в том, что ауторепродукция должна быть единственным способом воспроизведения наследственных молекул. Линейное наращивание как альтернатива ауторепродукции для таких гигантских молекул в условиях сравнительно небольших энергетических расходов живой клетки практически исключено, т.к. оно сопряжено с работой огромного числа ферментов, которые должны распознавать информационно значимые последовательности нуклеотидов хромосомной ДНК. В то же время матричное копирование возможно с помощью всего нескольких, максимум немногих десятков ферментов.

 

Хроматин и компактизация хромосом

 

Возникает вопрос, каким образом хромосомная ДНК упаковывается в интерфазную и митотическую хромосому? Выяснено, что эукариотические хромосомы имеют несколько уровней организации, соответствующих уровням компактизации ДНК. От этой организации в значительной мере зависят и другие элементарные генетические процессы. Комплекс ДНК с белками, имеющий специфическую структурную организацию, получил название хроматина, которое ранее применялось для обозначения вещества хромосом. Существенные элементы хроматина - нуклеосомы, дисковидные частицы 10 нм в диаметре. Нуклеосомы образуются в результате взаимодействия четырех классов основных белков - гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, причем молекулы двух последних гистонов могут in vitro формировать тетрамер, к которому присоединяются два димера - Н2А Н2В. Участок двойной спирали ДНК образует 13/4 оборота вокруг так называемой сердцевины нуклеосомы. Этот участок ДНК, непосредственно связанный с сердцевиной, имеет постоянную длину, равную 140 п.н. В то же время межнуклеосомные линкеры (связки) варьируют по длине от 15 до 100 п.н. и даже больше. Таким образом, закручивание ДНК вокруг нуклеосомы уменьшает ее длину в 7 раз. Еще один тип гистонов - Н1 - непосредственно в формировании нуклеосом не участвует. Он прикреплен к линкеру обоими своими концами и стабилизирует связь нуклеосом, образующих спираль более высокого порядка - соленоид, диаметр которого 25-50 нм. Конденсация ДНК в структуре соленоида дополнительно (к нуклеосомному уровню) уменьшает ее длину в 6 раз. В интерфазных хромосомах путем еще одного цикла конденсации соленоиды образуют полые трубочки диаметром 200 нм, что уменьшает длину ДНК еще в 18 раз. В метафазе вследствие дальнейшей конденсации возникает большая образованная дезоксинуклеопротеидом спираль диаметром около 600 нм. В результате строго упорядоченной иерархии спиралей, в основе которой лежит нуклеосома, в митозе и мейозе хромосомы эукариот совершают цикл компактизации-декомпактизации. Следствие этого цикла - укорочение метафазных хромосом по сравнению с размерами заключенной в них молекулой ДНК в 103- 104 раз. По-видимому, цикл компактизации-декомпактизации регулируется белками хроматина негистонового типа. Возможно, что некоторые из них выполняют и структурную роль, образуя элементы каркаса метафазных хромосом. В последнее время цитологи много внимания уделяют связи хромосом с ядерной мембраной. Ю.С. Ченцовым и его сотрудниками открыта специальная частица, обеспечивающая связь хроматина с ядерной мембраной, которую предложено называть анкоросомой (якорной частицей).

 

Особенности репликации эукариотических хромосом

 

Как и у прокариот, репликация ДНК в клетках эукариотических организмов осуществляется полуконсервативно, о чем свидетельствует распределение 3Н-тимидиновой метки по сестринским хроматидам во втором и последующих митозах после инкубации клеток с радиоактивными предшественниками. Выяснено, что репликация у эукариот носит двунаправленный характер.

Принцип регуляции репликации ДНК эукариот в онтогенезе был открыт английским цитогенетиком Г. Кэлланом в 1972 г. С помощью радиографии меченных 3Н-тимидином волокон ДНК, полученных из клеток животных непосредственно на предметном стекле, Кэллан определил скорость репликации и расстояние между соседними центрами инициации в S-фазе соматических и эмбриональных клеток. По первому показателю между этими типами клеток больших различий не наблюдалось. Число сайтов инициации репликации было максимальным в раннем эмбриогенезе, минимальным в предмейотической S-фазе и промежуточным в соматических клетках. Эти данные в принципе были подтверждены позднее прямым электронно-микроскопическим анализом реплицирующейся ДНК из дробящихся яиц дрозофилы. Таким образом, суть регуляции процесса репликации у эукариот заключается в изменении числа сайтов инициации репликации. Этот механизм позволяет увеличить продолжительность S-фазы (а, следовательно, всего митотического цикла) с 3,5 (на ранних стадиях дробления яиц дрозофилы) до десятков часов в предмейотической S-фазе. Упаковка ДНК и гистонов в нуклеосомы происходит в фазе S, поскольку гистоны синтезируются синхронно с репликацией ДНК.

В определенных тканевых клетках для отдельных генов имеется свой порядок (календарь) репликации по отрезкам S-фазы. Репликация гетерохроматина приходится на конец S-фазы. Это относится как к конститутивному, так и к факультативному гетерохроматину, например, к Х-хромосомам самок млекопитающих. У нормальных самок, имеющих две Х-хромосомы, одна реплицируется в конце S-фазы, другая - синхронно с аутосомами. Предполагается, что задержка репликации гетерохроматических районов обусловливает их постоянную компактизацию и таким образом поддерживает состояние функциональной неактивности ДНК этих районов.

 

Транскрипция ДНК

 

Воспроизводство генетического материала обеспечивается репликацией ДНК, приводящей к ее самокопированию в виде двух идентичных дочерних молекул. Однако проблема химических основ наследственности включает и вопрос о том, каким образом осуществляется гетерокаталитическая функция ДНК, т.е. экспрессия генов.

Сформулированная Ф.Криком так называемая центральная догма молекулярной биологии утверждает, что перенос генетической информации осуществляется:

ü от ДНК к ДНК (путем репликации);

ü от ДНК через информационную, или матричную РНК (иРНК) к белку.

Несмотря на то, что в последнее десятилетие на примере РНК-содержащих вирусов была доказана возможность переноса генетической информации в направлении от РНК к ДНК с помощью процесса обратной транскрипции, основным путем экспрессии генов является их транскрипция, т.е. синтез одной цепи иРНК по матрице ДНК, и последующая трансляция этой иРНК на рибосомах, т.е. сборка аминокислот в полипептидную цепь на матрице иРНК. В клетках эукариот эти процессы отделены друг от друга в пространстве и во времени, поскольку первый происходит в окруженном ядерной мембраной ядре, откуда синтезированная иРНК поступает в цитоплазму, а затем начинает транслироваться на рибосомах. У прокариот с их плавающей в цитоплазме хромосомой (нуклеоидом) указанные процессы не разобщены и трансляция генных транскриптов, т.е. молекул иРНК, начинается до полного завершения их синтеза одновременно на многих рибосомах. Сопряженность транскрипции и трансляции у бактерий приводит к тому, что при 370 С за 1 секунду синтезируется»15 кодонов (т.е. триплетов нуклеотидов в иРНК, кодирующих определенную аминокислоту), а за одну минуту- 2500 нуклеотидов. Это хорошо согласуется со скоростью синтеза белка, равного при 370 С примерно 15 аминокислот в 1 с. С момента инициации экспрессии гена его иРНК появляется в клетке через 2,5 мин, а соответствующий белок - еще через 30 с.

Как правило, лишь одна цепь ДНК, называемая антикодирующей, служит матрицей для синтеза комплементарной молекулы иРНК, осуществляемого ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Противоположная ей цепь, последовательности нуклеотидов в которой совпадает с последовательностями иРНК, называется кодирующей. Подобно синтезу ДНК, синтез иРНК также идет в направлении 5¢-3¢, поэтому он всегда начинается с 3¢-конца антикодирующей цепи. Следует иметь в виду, что у двух разных генов, расположенных на одной молекуле ДНК в пределах одной хромосомы, даже если они сцеплены друг с другом, кодирующая цепь может не совпадать. Это означает то, что транскрипция молекулы ДНК, образующей ряд генов, происходит с переменой матрицы. Вместе с тем в каждом данном гене транскрибируется лишь одна цепь.

Существование иРНК было теоретически доказано Уотсоном и Криком при рассмотрении вопроса о том, каким образом заложенная в двуспиральной ДНК генетическая информация реализуется при синтезе белка. Экспериментально же это впервые доказано в работе Э. Волкина и Л. Астрахана (1962), исследовавших процесс синтеза белка в клетках E.coli, инфицированных фагом Т2. Они обнаружили, что при фаговой инфекции в бактериальных клетках резко усиливается синтез молекулы РНК, комплементарной по своему составу одной из цепей ДНК фага Т2, но не ДНК E.coli. Время полураспада этой РНК составляет всего несколько минут. Позднее in vitro было показано, что такие короткоживущие РНК направляют синтез специфических фаговых белков.

У эукариот прямые доказательства синтеза иРНК в ядре и ее последующего перехода в цитоплазму были получены с помощью импульсного мечения вновь синтезирующейся РНК 3Н-уридином и последующей ауторадиографии. Такие эксперименты были проведены, в частности, на клетках водорослей Tetrahymena.

Катализирующие синтез иРНК-полимеразы обычно представляют собой сложные белки. Так, один из наиболее изученных ферментов этого типа - РНК-полимераза E. сoli - имеет Мr 480 000 и состоит из 5 полипептидных цепей, из которых 4 (2a, b, b¢) образуют стержень, или кор-фермент. Способность РНК-полимеразы распознавать начало данного гена и присоединяться к специфическому для каждого гена сайту инициации транскрипции, или промотору, определяется пятым полипептидом d (сигма-фактор). У эукариот известно 3 типа РНК-полимераз, ответственных за синтез различных классов РНК. Наиболее активна РНК-полимераза I, обнаруженная в ядрышках. Она транскрибирует лишь гены, кодирующие рРНК (т.е. РНК, входящие в состав рибосом), что составляет 50-70 % от общего синтеза РНК. РНК-полимераза II локализована в нуклеоплазме и синтезирует 20-40 % всей клеточной РНК, в том числе РНК-предшественники иРНК в виде гетерогенной (состоящей из различных молекул) ядерной РНК. РНК-полимераза III также находится в нуклеоплазме и ответственна за синтез большей части мелких ядерных РНК и транспортных РНК.

 

Этапы транскрипции

 

Различают три этапа транскрипции: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация

Последовательность ДНК, транскрибирующаяся в одну иРНК, начинающаяся просмотром на 5¢-конце и заканчивающаяся терминатором на 3¢-конце, является единицей транскрипции и соответствует современному понятию “ген”. Контроль экспрессии генов может осуществляться на этапе инициации транскрипции. На этом этапе РНК-полимераза распознает промотор - фрагмент длиной 41-44 п.н. Транскрипция ДНК происходит в направлении 5¢-3¢, или слева направо. Последовательности, лежащие вправо от стартового нуклеотида, с которого начинается синтез иРНК, обозначаются номерами со знаком “+” (+1, +2 и т.д.), а находящееся левее - со знаком “-” (-1,-2 и т.д.). Таким образом, область ДНК, к которой присоединяется РНК-полимераза, занимает участок с координатами» от -20 до +20. Минимальный участок, связанный с РНК-полимеразой, состоит у E.coli из 12 п.н. Во всех промоторах присутствуют одни и те же нуклеотидные последовательности, называемые консервативными. Такие последовательности служат сигналами, распознаваемыми РНК-полимеразами. Стартовая точка обычно, хотя и не всегда, представлена пурином (чаще аденином, чем гуанином). Сразу же влево от нее располагаются 6-9 п.н., известные как последовательность (или ящик) Прибнова: ТАТААТ. Она может несколько варьировать, но первые два основания (ТА), по крайней мере, у E.coli, встречаются в большинстве промоторов. Предполагается, что, поскольку ее образует участок богатый АТ-парами, связанными двумя, а не тремя, как ГЦ-пары, водородными связями, ДНК в этом месте легче разделяется на отдельные нити. Это создает условия для функционирования РНК-полимеразы. Наряду с этим последовательность Прибнова нужна для ориентирования РНК-полимеразы таким образом, чтобы синтез иРНК шел слева направо, т.е. в направлении 5¢-3¢. Центр “ящика Прибнова” приходится на нуклеотид в положении -10. Близкая по составу последовательность расположена в другом участке с центром в положении -35, т.е. на расстоянии 35 п.н. от стартовой точки. Этот участок, состоящий из 9 п.н., обозначают как последовательность 35, или район распознавания. Он является сайтом, к которому присоединяется d-фактор, тем самым определяя эффективность, с которой РНК-полимераза распознает определенный промотор. Есть промоторы, с которых РНК-полимераза не может начать транскрипцию без помощи специальных белков. Одним из них служит фактор САР, или CRP.

Изменение специфичности распознавания субстрата РНК-полимеразой может серьезно отразиться на жизнедеятельности организма. Так, образование спор сенной палочки (Bacillus subtilis) зависит от того, какой из d-факторов функционирует. Замена d-фактора с Мr 55000 на d-фактор с Мr 37000 и 29000 при неизменности кор-фермента приводит к тому, что РНК-полимераза начинает распознавать и транскрибировать хромосомные гены, ответственные за ранние и последующие этапы спорообразования. С заменами d-фактора связано также переключение транскрипции с одних генов на другие у фага SPOI B. subtilis. Каждый d-фактор распознает собственные, характерные для него последовательности в промоторе с координатами- 10 и -35. Недавно это продемонстрировано и на E.coli. Известно, что при инкубации при повышенной температуре (420 С) в клетках E.coli начинает интенсивно экспрессироваться группа генов, объединяемая общим названием “гены теплового шока”. В отличие от других генов E.coli, транскрибирующихся РНК-полимеразой, содержащей d-фактор с Мr 70000, гены теплового шока транскрибируются комплексом кор-фермента РНК-полимеразы с иным d-фактором с Мr 32000. Примечательно, что в эту группу генов входит и ген, кодирующей d-фактор с Мr 70000. Следовательно, второй d-фактор придает клетке дополнительные возможности для избирательной регуляции генной активности, направленной, в частности, на усиление продукции основного d-фактора, повышающее уровень транскрипции в клетке в ответ на изменение внешних условий.

У эукариот более подробно изучены промоторы, взаимодействующие с РНК-полимеразой II. Они содержат три гомологичных участка в районах с координатами -25, -27, а также в стартовой точке. Стартовым основанием служит аденин, фланкированный с обеих сторон пиримидинами. На расстоянии 19-27 п.н. влево от этого участка расположены 7 п.н. ТАТАА (или Т)АА (или Т), известных как последовательность ТАТА, или “ящик Хогнесса”. Часто он окружен участками, богатыми ГЦ-парами. Последовательность ТАТА напоминает “ящик Прибнова” у прокариот, но расположена в среднем на 15 п.н. левее стартовой точки. Еще левее в положении от -70 до -80 находится последовательность ГТЦ (или Т) ЦААТЦТ, называемая также “ящик ЦААТ”. Предполагается, что последовательность ТАТА контролирует выбор стартового нуклеотида, а ЦААТ - первичное связывание РНК-полимеразы с ДНК-матрицей.

Элонгация

Стадия элонгации иРНК имеет ряд аналогий с элонгацией ДНК. В качестве предшественников для нее необходимы рибонуклеозидтрифосфаты. Этап элонгации транскрипции, т.е. рост цепи иРНК, происходит путем присоединения рибонуклеозидмонофосфатов к 3-концу цепи с одновременным освобождением пирофосфата. Копирование у эукариот обычно осуществляется на ограниченном участке ДНК (т.е. в пределах гена), хотя у прокариот в ряде случаев транскрипция может проходить последовательно через несколько сцепленных генов (цистронов), формирующих единый оперон, и с одного общего промотора. В таком случае образуется полицистронная иРНК.

Терминация

Транскрипция завершается в специфическом участке ДНК, содержащем терминирующую последовательность. В клетках E.coli выявлен особый белок (ро-фактор), повышающий точность терминации. Белок присоединяется к 5-концу растущей иРНК и продвигается по ней, постепенно приближаясь к ДНК и как бы преследуя РНК-полимеразу. В момент, когда РНК-полимераза останавливается в сайте-терминаторе, фермент захватывается ро-фактором и сбрасывается с ДНК. Терминатор содержит особую последовательность оснований, прочитывающуюся одинаково в обеих цепях ДНК, но в противоположных направлениях.

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...