 |
стадия I – начавшим споруляцию и сформ-шим аксиальный филамент,
|
|
|
|
31-32.
31. Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции контроля инициации репликации ДНК.
32. Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции процессинга РНК и ее трансляции.
В регуляции разных этапов синтеза белка как многостадийного процесса задействованы различные типы нетранслируемых РНК. Так, инициация репликации ДНК невозможна без праймеров РНК-овой природы.
Инициация транскрипции может регулироваться специальными малыми РНК через их воздействие на процесс метилирования ДНК.
В регуляции “дозревания” - процессинга пре-мРНК эукариот особенно значительна роль малых ядерных РНК (мяРНК) U1 - U6, входящих в состав сплайсосомы и избирательно распознающих сайты сплайсинга.
В контроле трансляции белковых молекул принимают участие особые антисмысловые РНК (antisense RNA, micRNA). Их название подчеркивает тот факт, что эти РНК комплементарны к “смысловой” мРНК - той, на которой закодирован белок. Антисмысловые РНК были сначала обнаружены у бактерий, затем - у эукариот. По принципу антисмысловых строятся РНК, регулирующие синтез белка по механизму РНК-интерференции или посттранскрипционного генного сайленсинга. На сегодняшний день известны два класса малых регуляторных РНК, способных вызвать устранение мРНК-матрицы или репрессию трансляции - siРНК и miРНК.
33. Антисмысловая РНК. МикроРНК как регулятор. РНК-интерференция.
В контроле трансляции белковых молекул принимают участие особые
антисмысловые РНК. Их название подчеркивает тот факт, что эти РНК комплементарны к“смысловой” мРНК– той, на которой закодирован белок. Антисмысловые РНК были сначала обнаружены у бактерий, затем– у эукариот. Бактериофаги используют антисмысловые РНК для регуляции своего жизненного цикла.
|
|
|
У бактерий антисмысловые РНК используются в регуляции:
– репликации и поддержания плазмид(например, инициации репликации
плазмидыColE I);
– транскрипции(например, гена белка, являющегося рецептором цАМФ)
– трансляции(например, при подавлении экспрессии одного из белков внешней мембраны E. coli).
У эукариот также было обнаружено участие антисмысловых РНК в регуляции синтеза белка. Мутации, нарушающие нормальное протекание
посттранскрипционного сайленсинга у них приводят к возрастанию восприимчивости к вирусной инфекции, повышенной подвижности транспозонов, дефектам в митозе, мейозе, к стерильности и другиМ нарушениям развития.
РНК-интерференция (“препятствие”)–это недопущение мРНК до трансляции на рибосомах с помощью маленьких антисмысловых РНК и специальных белковых комплексов. Известно два основных класса малых РНК, способных вызвать РНК-интерференцию:
– siРНК– малые интерферирующие РНК(small interfering RiboNucleic Acids),
длиной19 – 25 нуклеотидов;
– miРНК– микроРНК, обычная длина которых– 21-22 нуклеотида.
Эти два класса малых РНК схожи по строению и механизму действия, но отличаются по происхождению, консервативности и группам регулируемых генов: – miРНК закодированы в ДНК клетки в специальных геномных локусах, отличных от других генов, тогда как siRNA могут иметь два источника– “собственные” транспозоны клетки или проникающие извне вирусы. – miРНК синтезируются из одноцепочечной РНК, сложившейся вдвойне с образованием короткой“шпильки”, а siРНК– из длинных двуцепочечных РНК или протяженных“шпилек”. – из одной молекулы-предшественника в случае miРНК формируется единственная двуспиральная структура“miРНК: miРНК”, а в случае siРНК– много двуцепочечных siРНК;
МикроРНК способны вызывать не только расщепление мРНК– РНК-интерференцию(аналогичноsiРНК), но и другой эффект– трансляционную
|
|
|
репрессию.
34. Посттрансляционная регуляция. Участие молекулярных шаперонов в регуляторных процессах.
После завершения трансляции большинство белков подвергается дальнейшим химическим модификациям, которые называются посттрансляционными модификациями. Посттрансляционные модификации могут регулировать продолжительность существования белков в клетке, их ферментативную активность и взаимодействия с другими белками. Иногда посттрансляционные модификации являются обязательным этапом созревания белка, в противном случае он оказывается функционально неактивным. Посттрансляционные модификации могут быть как широко распространёнными, так и уникальными. Универсальная модификация -убиквитинирование (присоединение к белку цепи из нескольких молекул короткого белка убиквитина), которое служит сигналом к расщеплению этого белка протеасомой. Другой распространённой модификацией является гликозилирование. К редким модификациям относят тирозинирование/детирозинирование и полиглицилирование тубулина.
Один и тот же белок может подвергаться многочисленным модификациям. Посттрансляционные модификации делят на: модификации главной цепи;
отщепление N-концевого остатка метионина; ограниченный протеолиз — удаление фрагмента белка, которое может происходить с концов (отщепление сигнальных последовательностей) или, в отдельных случаях, в середине молекулы; присоединение различных химических групп к свободным амино- и карбоксильной группам (N-ацилирование, миристоилирование); модификации боковых цепей аминокислот;
присоединение или отщепление небольших химических групп (гликозилирование, фосфорилирование); присоединение липидов и углеводородов; изменение стандартных аминокислотных остатков на нестандартные (образование цитруллина);
образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина;
присоединение небольших белков (сумоилирование и убиквитинирование).
Шапероны. В клетках существует группа белков, функция которых — обеспечение правильного сворачивания других белков после их синтеза на рибосоме, восстановление структуры белков после их повреждения, а также создание и диссоциация белковых комплексов. Эти белки называются шаперонами. Концентрация многих шаперонов в клетке возрастает при резком повышении температуры окружающей среды, поэтому они относятся к группе Hsp (англ. heat shock proteins — белки теплового шока).
|
|
|
35. Фолдинг и деградация белков как компоненты регуляторных систем.
Деградация белков в клетке. Белки выполняют в клетке закреплённую за ним функцию, а затем, в определённый момент, клетке необходимо от него избавиться. Необходимость избавиться от белка обусловлена рядом причин: во-первых, дальнейшая активность белка может навредить клетке, во-вторых, нужно синтезировать новые белки, а перегрузка цитоплазмы полипептидами является источником апоптоза. Переставшие быть необходимыми, белки подвергаются протеолитической деградации.
Фо́лдингом белка называют процесс спонтанного сворачивания полипептидной цепи в уникальную нативную пространственную структуру (так называемая третичная структура).
Каждая молекула белка начинает формироваться как полипептид, транслируемый из последовательности мРНК в виде линейной цепочки аминокислот. У полипептида нет устойчивой трёхмерной структуры. Однако все аминокислоты в цепочке имеют определённые химические свойства: гидрофобность, гидрофильность, электрический заряд. При взаимодействии аминокислот друг с другом и клеточным окружением получается хорошо определённая трёхмерная структура — конформация. В результате на внешней поверхности белковой глобулы формируются полости активных центров, а также места контактов субъединиц мультимерных белков друг с другом и с биологическими мембранами.
В редких случаях нативными могут быть сразу две конформации белка. Они могут сильно различаться, и даже выполнять различные функции. Для этого необходимо, чтобы в разных областях фазового пространства белковой молекулы существовали два примерно равных по энергии состояния, каждое из которых будет встречаться в нативной форме с соответствующей вероятностью. Для стабилизации третичной структуры многие белки в клетке подвергаются посттрансляционной модификации. Часто встречаются дисульфидные мостики между пространственно близкими участками полипептидной цепи. В фолдинге участвуют белки-шапероны. Существует четыре типа молекул, которые играют роль таких шаперонов.
|
|
|
1. Молекулы, обеспечивающие правильный фолдинг белков.
2. Молекулы, созданные для удержания частично свернутой молекулы белка в определенном положении. Это необходимо, чтобы система имела возможность закончить фолдинг.
3. Шапероны, разворачивающие белки с неправильной формой.
4. Шапероны, сопровождающие белки, транспортируемые через клеточную мембрану.
36. Формирование нативной трехмерной структуры белков.
Трехмерная структура белка играет важную роль в обеспечении его специфической функциональной активности. Она формируется в результате взаимодействия структур более низких уровней. Третичная структура — пространственное строение полипептидной цепи. Структурно состоит из элементов вторичной структуры, стабилизированных различными типами взаимодействий, в которых гидрофобные взаимодействия играют важнейшую роль. В стабилизации третичной структуры принимают участие:
ковалентные связи (между двумя остатками цистеина — дисульфидные мостики); ионные связи между противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков; водородные связи; гидрофобные взаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула сворачивается так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярные гидрофильные боковые группы.
Между уровнем вторичной структуры и атомарной пространственной выделяют ещё один уровень — мотив укладки. Мотив укладки определяется взаимным расположением элементов вторичной структуры (α-спиралей и β-тяжей) в пределах белкового домена — компактной глобулы, которая может существовать или сама по себе или входить в состав более крупного белка.
37.. Молекулярные шапероны семейств Hsp60 и Hsp70 у про- и эукариот.
Фолдинг растущего в процессе трансляции полипептида обеспечивается его взаимодействием сначала с фактором TF, а затем, при достаточном удлинении полипептидной цепи – с системой шаперона Hsp70, включающей собственно шаперон, кошаперон Hsp40 и факторы нуклеотидного обмена (NEF). Наиболее изученной является Hsp70 -система Escherichia coli. Образование временных комплексов Hsp70 с ненативными белками-мишенями предотвращает неспецифическую агрегацию и деградацию последних внутриклеточными протеиназами и способствует правильному фолдингу диссоциированной мишени, происходящему либо спонтанно, либо с участием других шаперонов. Шапероны Hsp70 состоят из трех доменов: высококонсервативный N-концевой нуклеотидсвязывающий домен объединен чувствительным к действию протеиназ линкерным участком с вариабельным субстратсвязывающим доменом; короткий С-концевой домен способен к взаимодействию с различными партнерными белками и модулированию шапероновой функции Hsp70; АТФ-форма Hsp70 обладает низким сродством к белкам-мишеням и высокой скоростью обмена субстратов, в то время как его AДФ-форма проявляет высокую аффинность к субстратам и демонстрирует низкую скорость их обмена.
|
|
|
Двудоменные кошапероны Hsp40 служат регуляторами АТФ-азной и шапероновой активностей Hsp70. Связывание полипептидных субстратов-мишеней с Hsp70 опосредовано предварительным образованием комплексов мишень–кошаперон с участием С-концевого домена Hsp40. Считается, что от 10 до 20% вновь синтезирующихся белков как в прокариотах, так и в
эукариотах подвергаются правильному фолдингу с участием системы Hsp70–Hsp40–NEF.
Шаперонины (или шапероны Hsp60) – это двухкамерные бочкообразные
структуры, сформированные двумя состыкованными олигомерными кольцами Hsp60, которые способны на своих противоположных
поверхностях попеременно связывать и инкапсулировать белки, подлежащие рефолдингу. При этом шаперонины узнают гидрофобные кластеры белковых мишеней, находящихся в состоянии «расплавленной глобулы»– промежуточной между нативным и развернутым состояниями белка, характеризующимся ослаблением взаимодействий между боковыми группами в аминокислотной цепи. Наиболее изученным является шаперонин GroEL E. coli, функционирующий в комплексе с кошаперонином GroES. Каждая субъединица гептамерного «кольца» GroEL состоит из трех доменов: апикального, содержащего общий центр связывания ненативных белков и кошаперонина, шарнирного промежуточного и С-концевого экваториального, несущего АТФ-азный центр. Экваториальные
домены обеспечивают бóльшую часть межсубъединичных контактов как внутри гептамерного кольца, так и между кольцами шаперона.
38.. Участие молекулярных шаперонов в регуляторных процессах.
Рабочий цикл шаперонных комплексов GroELS и DnaKJ-GrpE.
Молекулярные шапероны – группа вспомогательных специализированных белков, предохраняющих растущую цепь от
ошибочных внутренних и внешних контактов. Биологические функции молекулярных шаперонов - коррекция структуры и конформации других белков клетке, предотвращение агрегации неправильно свернутых или частично развернутых белков, разрушение и солюбилизация стабильных
белковых агрегатов, разворачивание нативных белковых субстратов для транслокации их через мембраны, разборке активных олигомерных структур и поддерживании их в состоянии неактивных мономеров, разворачивании активных мономеров для их последующей деградации. Шапероны контролируют процессы ремоделирования нативного состояния регуляторных и сигнальных белков в клетке. Молекулярные шапероны являются основными компонентами системы контроля качества клеточного
протеома.
Hsp70-система Escherichia coli, состоит из шаперона DnaK, кошаперона DnaJ и NEF-белка GrpE, причем, белки DnaJ и GrpE функционируют в системе в форме димеров. Гомологом Hsp60 у E. coli является GroEL, формирующий гигантский комплекс с GroES. Комплекс GroEL- GroES имеет сходство с эукариотической протеосомой 26S, ответственной за деградацию меченных убихитином белков.
При фолдинге белки проходят через ряд промежуточных конформаций, имеющих более высокую энергию, чем конечная конформация. Поэтому для многих белков существуют локальные энергетические минимумы, в которых частично свернутый белок может задержаться надолго. Белки, требующие помощи в фолдинге, опознаются аппаратом DnaK-DnaJ-GrpE, через гидрофобные участки. Молекулярный шаперон, гидролизуя АТФ, "перетасовывает" конформацию многих оснований, разворачивая белок и позволяя ему свернуться заново. Если нативная конформация не достигается таким путем, белок переходит в ведение шаперонина GroES-GroEL. Полость шаперонина защищает белок от контакта с раствором и другими субъединицами, предотвращая агрегацию и позволяя белку спокойно свернуться.
39. Деградация белков: АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26S-протеасома эукариот. АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26S-протеасома эукариот
АТФ-зависимые протеазы. За распознавание субстрата у прокариот отвечают протеазы, поэтому их в клетке несколько. АТФзависимые протеазы-крупные олигомерные комплексы. Протеазные сайты располагаются во внутренней камере олигомера. Поступление субстрата в такую полость обеспечивается АТФазными доменами (субъединицами). Поскольку распознавание субстратов осуществляется регуляторными АТФазами, свойства субстратов, приводящие к их деградации, не зависят от свойств, необходимых для разрезания пептидных связей. Как только белок распознается и связывается регуляторным АТФазным доменом, начинается последовательная деградация полипептидной цепи с разрезами через каждые 5-10 аминокислот. У E.coli 4 АТФ-зависимые протеазы. ClpAP ClpXP. У этих протеаз АТФазная и протеазная активность принадлежат разным субъединицам, эти субъединицы способны действовать самостоятельно. ClpA и ClpX могут действовать как шапероны. Гены clpX и clpP составляют оперон, clpA расположен отдельно в моноцистронном опероне. Оба оперона имеют типичные промоторы теплового шока. ClpYQ/HslUV. HflB(FtsH). Zn и АТФ-зависимая протеаза, участвующая в деградации цитоплазматических и мембранных белков, включая RpoH, SecY (часть аппарата секреции). Единственная АТФ-зависимая протеаза, существенная для жизни E. coli. В опероне с RpoH-зависимым промотором. Lon. Деградирует белок N фага λ, ингибитор клеточного деления SulA, позитивный регулятор биосинтеза капсулы RcsA и др. Кроме специфических мишеней, Lon деградирует большинство аномальных белков E. coli. Белок – гомотетрамер, имеет сайты связывания с АТФ и ДНК, причем связывание с ДНК стимулирует протеазную активность. Транскрибируется с промотора теплового шока. В белке можно выделить два домена – собственно протеазный с карбоксильного конца с сериновым остатком в активном сайте
и следующий за ним АТФазный. Эти два домена могут быть экспрессированы как отдельные полипептиды, смесь которых функционально соответствует интактной протеазе Lon. 26S ПРОТЕАСОМА. Протеасома, осуществляющая убиктивин-зависимую деградацию белков, состоит из двух основных субкомплексов: коровой 20S протеасомы и активатора РА700 или 19S регуляторной частицы. 20S протеасома содержит протеазные субъединицы, а 19S протеасома включает субъединицы, способные связывать полиубиктиновые цепи и субстрат, а также изопептидазы, отщепляющие убиктивин, и АТФазы, которые обеспечивают разворачивание субстрата и транслокацию его в канал коровой протеасомы. 19S протеасомы могут присоединяться к 20S протеасоме с одного или обоих концов, в результате образуются 26S и 30S протеасомы соответственно. Помимо 19S RP, в состав 26S протеасомы могут входить альтернативные регуляторные частицы: PA28α/β (или 11S REG), PA28γ (или REGγ), PA200, PI31. Встречаются асимметричные изоформы 26S протеасомы, содержащие разные регуляторные частицы на концах 20S протеасомы. Кроме того, обнаружены изоформы протеасомы, в которых регуляторные частицы замещены мультисубъединичным белковым комплексом PC530 или COP9 сигналосомой.
40.Механизм распознавания аномальных белков.
Аномальные белки возникают в результате ошибок при синтезе, когда в цепь встраивается неправильная аминокислота, или в результате химических повреждений, таких, как окисление боковых цепей аминокислот. Разнообразные мутантные формы обычных белков также распознаются в качестве аномальных. Механизм «узнавания» аномальных или нефункциональных белков неизвестен, скорее всего, важную роль в нем играют особенности третичной структуры белков, и замена даже одной аминокислоты сильно снижает устойчивость белка к внутриклеточному протеолизу. Последнее обстоятельство может существенно мешать получению микроорганизмов-сверхпродуцентов, у которых повышенное образование целевого продукта обусловлено мутациями по соответствующим ферментам. Такие ферменты будут восприниматься системой узнавания как аномальные и подвергаться протеолизу, что тормозит биосинтетические процессы, а иногда и рост микроорганизма. Специфический протеолиз может дополнять регуляцию по механизму катаболитной репрессии. Решающую роль играет протеолиз в так называемой SOS-регуляции, т.е. активации SOS-регулона, включающего около 20 генов, которые индуцируются в ответ на некоторые повреждения ДНК и образуют продукты, участвующие в ее репарации. Среди этих продуктов присутствует белок RecA, участвующий в ряде клеточных процессов является более «быстродействующим» механизмом
и раньше откликается на изменение внешних условий, чем регуляция
биосинтеза этих посредников. Оба уровня регуляции необходимы для координированного управления биохимическими процессами в клетке. В свою очередь, процессы регуляции активности белковых посредников можно разделить на две большие группы: регуляция активности путем обратимой ковалентной модификации посредника и регуляция активности без ковалентной модификации посредника.
41. Система убиквитинирования белков
Убиквитинлигаза (англ. E3 ubiquitin ligase) — фермент-лигаза, ковалентно присоединяющий убиквитин к белку-мишени изопептидной связью. Убиквитинлигазы являются частью системы убиквитинопосредованного распада белка в протеасомах. Известно, что протеасома расщепляет не любые белки, а только те, которые были «помечены» убиквитином. Убиквитинлигазы специфично узнают белки-субстраты и участвуют в их полиубиквитинировании (присоединении цепочек из молекул убиквитина), которое, в конечном счёте, приводит к деградации последних в протеасомах. Кроме этого, убиквитинлигазы осуществляют и другие модификации белков убиквитином, такие как моноубиквитинирование и мультиубиквитинирование, которые имеют регуляторное значение.
Механизм убиквитинирования белков. Процесс убиквитинирования белков происходит в несколько стадий, ферменты, катализирующие отдельные его этапы, получили условные названия Е1 (убиквитинактивирующий фермент), Е2 (убиквитинконъюгирующий фермент) и Е3 (убиквитинлигаза). Фермент Е1 АТФ-зависимо активирует убиквитин с формированием высокоэнергетической тиоэфирной связи между карбоксильной группой С-концевого остатка глицина убиквитина и остатком цистеина в молекуле Е1. Затем активированный убиквитин переносится на молекулу Е2 с формированием сходной тиоэфирной связи. Убиквитинлигазы взаимодействуют одновременно с Е2 благодаря Е2-связывающему домену и с белком-субстратом благодаря субстратсвязывающему домену. Они осуществляют перенос активированного убиквитина с Е2 на субстрат либо напрямую, либо через образование промежуточного тиоэфирного соединения.Чаще всего убиквитин-лигазы катализируют образование изопептидной связи между карбоксильной группой С-концевого остатка глицина убиквитина и ε-аминогруппой одного из остатков лизина в белке-мишени, реже связь образуется между убиквитином и N-концевой аминогруппой или боковой цепью цистеина белка. После присоединения первой молекулы убиквитина к субстрату Е3-ферменты последовательно добавляют ещё несколько молекул, так же соединяя их изопептидной связью. Эта модификация называется полиубиквитинированием. В молекуле убиквитина присутствуют 7 остатков лизина, каждый из которых, как считают, может участвовать в образовании изопептидной связи. Последствия полиубиквитинирования зависят от того, какой из этих остатков был задействован в формировании цепочки. Так, полиубиквитиновые цепи, соединённые при участии Lys-48, чаще всего являются сигналом к протеасомальной деградации (минимальная длина цепочки — 4 молекулы убиквитина), а образованные через Lys-63 играют регуляторную роль в эндоцитозе белков(процесс транспорта макромолекул внутрь клетки (белков, полисахаридов, полинуклеотидов и т. д.) и репарации ДНК. Также выделяют и другие типы модификаций, катализируемых Е3-ферментами: моноубиквитинирование (присоединение единственного остатка убиквитина) и мультиубиквитинирование, или множественное моноубиквитинирование. Моноубиквитинирование — довольно распространённая регуляторная посттрансляционная модификация, которая может влиять на способность белка взаимодействовать с другими молекулами, на его внутриклеточную локализацию, а также может служить сигналом к его деградации в лизосомах. Мультиубиквитинирование мембранных белков приводит к их эндоцитозу и расщеплению в лизосомах. Убиквитинлигазы разделяют на три семейства в зависимости от структуры домена, связывающего убиквитинконъюгирующий фермент (E2): убиквитинлигазы, содержащие HECT-домен(homologous to E6-AP carboxyl terminus), RING-домен (англ. really interesting new gene) или U-бокс.
42. Роль контролируемого протеолиза в регуляции метаболизма у про- и эукариот.
Протеолиз (проте [ины] + lysis разложение, распад) — ферментативный гидролиз белков и пептидов, катализируется протеолитическими ферментами (пептид-гидролазами, протеазами) и играет важную роль в регуляции обмена веществ в организме.
Протеолитические ферменты играют ключевую роль в жизненном цикле клеток всех организмов, представляющих три основных эволюционных клеточных домена жизни - бактерии, эукариоты и археи.
Клетки эукариот содержат широкий спектр различных протеиназ, локализованных практически во всех структурных компанентах клетки и цитоплазме. Цитоплазматические долгоживущие белки, переносятся эукариотическими клетками для деградации в лизосомы, а короткоживущие цитоплазматические белки подвергаются деградации цитоплазматическими протеолитическими системами. Таким образом, в клетках эукариот интенсивная протеолитическая деградация белков
и пептидов осуществляется как в лизосомах, так и в цитоплазме. Деградации белков в лизосомах. Лизосомы являются классическим компартментомпротеолиза, они содержат множество неспецифических протеиназ различного типа. Во внутриклеточные процессы деградации белков в значительнойстепени вовлечены цистеиновые протеиназы, а также аспартатные, сериновые, металлопротеиназы иих ингибиторы. Лизосомы, которые находят почтиво всех клетках эукариот, крайне гетерогенны. Существует множество путей, которыми внутриклеточные белки могут доставляться в лизосомы для последующего протеолиза. Микро- и макроаутофагии не проявляют селективности и различные белки, как и другие субстраты, захватываются и доставляются в лизосомы с одинаковой скоростью. Эндоцитоз, напротив, высоко селективен как в интернализации белков плазматических мембран, так в последующем попадании их в лизосомы. Путь импорта белков с участием АТФ для протеолиза в лизосомах также высокоселективен и поставляет только цитозольные белки, содержащие пептидный мотив, который биохимически родственен следующей последовательности аминокислот Lys-Phe-Glu-Arg-Gln. Деградация белков в цитоплазме. В отличии от лизосом цитоплазма содержит протеиназы, высокоспецифичные по отношению кбелкам, которые отбираются в клетке для деградации. Открыты пути деградации белков, в которых в различных комбинациях принимают участие олигопептид убиквитин и убиквитиновая система, способная узнавать и метить белки, подлежащие деградации, АТФ и полиферментный комплекс, называемый протеасомой, который кроме нескольких типов протеолитической активности обладает еще и АТФ-азной активностью, а также шапероны, специфические белки, контролирующие свертывание (фолдинг) полипептидных цепей, их миграцию и протеолиз. Изменение скоростей синтеза и распада белков может играть решающую роль в адаптационных процессах, связанных с дифференцировкой, ростом, гормональными эффектами, питанием, атрофией и болезнями.
Прокариоты. Внутриклеточный селективный гидролиз белков, направленный на поддержание низкого базального уровня регуляторных белков и быстрое удаление мутантных, поврежденных и других опасных для клетки белков, выполняется специфическими ферментами - АТР-зависимыми протеиназами. Они объединяют в своей структуре АТРазные и протеолитические компоненты и относятся к выявленному в 1990-х гг. суперсемейству ААА+-белков. Исторически первой обнаруженной энергозависимой протеиназой явилась Lon-протеиназа Escherichia coli. К настоящему времени в бактериальных клетках выявлено четыре группы АТР-зависимых протеиназ: Lon (подсемейство LonA), FtsH, ClpAP/XP и HslUV/CodWX.
43. Межклеточные коммуникации.
Есть данные о том, что «бактерии, как и все живые организмы, в процессе жизнедеятельности получают, обрабатывают и используют информацию об окружающем мире… Обмен информацией или ее получение от других живых объектов называется коммуникацией» Микроорганизмы, и в их числе бактерии, используют следующие каналы коммуникации:
Контактная коммуникация предполагает наличие межклеточных контактов различных типов – цитоплазматических мостиков (плазмодесм), участков слияния наружных мембран (у грамотрицательных бактерий) или пептидогликановых клеточных стенок (у грамположительных бактерий). Контактная коммуникация между клетками микобактерий Myxococcus xanthus необходима для реализации поздних стадий формирования плодовых тел. Межклеточные контакты формируются за счет многообразных поверхностных структур, включая микрофибриллы, шишковидные выступы, гликокаликс(клеточная оболочка).
Дистантная химическая коммуникация между пространственно разделенными клетками. Многие из участвующих в дистантной химической коммуникации веществ отвечают за координацию в масштабах колонии (биопленки) процессов роста и развития клеток. Такие сигнальные вещества обозначаются в литературе как ауторегуляторные вещества, или ауторегуляторы и определяются как “микробные метаболиты, выделяемые всей популяцией клеток или ее частью в окружающую среду, играющие важную сигнальную роль и влияющие на физиологическое состояние и репродуктивные способности организмов». Так, установлено, что в период лаг-фазы и экспоненциальной фазы роста культура E. coli выделяет в среду вещества, стимулирующие рост другой культуры E. coli (аутостимуляторы), а в период замедления роста и в стационарную фазу – вещества, ингибирующие рост другой культуры этой бактерии (аутоингибиторы).
Детально изучены так называемые кворум-зависимые (quorum-sensing, QS) системы, ставящие под контроль плотности микробной популяции (кворума), оцениваемой по концентрации вырабатываемых всеми клетками популяции сигнальных веществ – феромонов (или аутоиндукторов), многие важные процессы. К этим процессам относятся: люминесценция, синтез антибиотиков и ферментных комплексов, межклеточный перенос генетической информации (трансформация, конъюгация), клеточная агрегация, секреция белков, формирование биоплёнок, споруляция, образование факторов вирулентности и др. «Бактерии образуют малые, легко диффундирующие молекулы, называемые аутоиндукторами, и когда эти сигнальные вещества достигают критической концентрации, соответствующие QS-системы активируются или репрессируются. У некоторых, но не у всех объектов, сами QS-системы регулируются по принципу положительной обратной связи (аутоиндукция)».
Так, у грамотрицательных бактерий в большинстве кворум-зависимых систем аутоиндукторами (феромонами) служат ацилированные гомосеринлактоны(АГЛ). Эти вещества связываются c R-белками, и полученный комплекс активирует транскрипцию генов, отвечающих за кворум-зависимые процессы. Если плотность бактериальных клеток достаточно высокая, то бактерии предпринимают те или иные коллективные действия. Например, морские бактерии Vibrio fischeri и V. harveyi начинают светиться.
У грамположительных бактерий распространены quorum-sensing системы, в которых роль феромонов (аутоиндукторов) играют пептиды, которые могут быть линейными или включать в себя тиолактоновое кольцо. Эти QS-системы являются двухкопонентными: содержат сенсорную гистидиновую киназу, которая в ответ на связывания феромона фосфорилирует второй компонент системы – белковый регулятор ответа. Запускается каскад киназ, в конечном счете фосфорилирующий и тем самым активирующий белок, который индуцирует транскрипцию определенного оперона ДНК.
Многие из изученных бактерий одновременно содержат несколько QS-систем. QS-системы вступают в разнообразные взаимоотношения между собой. Они могут функционировать параллельно или последовательно, могут конкурировать или противодействовать друг другу.
Дистантная физическая коммуникация. В дистантной передаче информации между клетками бактерий предполагается участие электромагнитных и звуковых волн разных диапазонов. Еще в 20-30-е годы ХХ века изучали «митогенетические лучи» (ультрафиолетовое излучение), кванты которого испускаются живыми клетками и стимулируют деление других клеток, в том числе и бактериальных. При изучении этих процессов одни предполагали вклад электромагнитных волн разных диапазонов, другие - роль ультразвуковых волн. В последующих изучениях было продемонстрировано синергидное (взаимоусиливающее) действие различных каналов межклеточной коммуникации, а именно химических сигналов и физических полей.
44. Регуляция синтеза экзоферментов и антибиотиков у Erwinia.
Фитопатогенные бактерии Erwinia carotovora продуцируют довольно широкий спектр гидролитических ферментов, деградирующих клеточные стенки растений. К таким ферментам относятся пектатлиазы, целлюлазы, полигалактуроназы и протеазы. Развитие этого патогена в растениях ведет к индукции этих ферментов, результатом чего является мацерация растительных тканей и развитие симптомов мягкой гнили. Продукция внеклеточных ферментов зависит от накопления N-3-оксогексаноил-L-гомосерин лактона, синтез которого детерминируется гомологами LuxI, которые у разных штаммов называются ExpI, CarI и HslI. Рядом с геном expI находится expR - гомолог luxR. Мутанты по гену expI имеют сниженную, а по гену expR – повышенную продукцию экзоферментов.
Кроме того, некоторые штаммы Erwinia carotovora продуцируют β-лактамные антибиотики широкого спектра действия - карбапенемы. Синтез карбапенемов координирован с экспрессией экзоферментов и может служить для ингибирования других бактерий при конкуренции за питательные вещества, высвобождающиеся при мацерации растительных тканей. Синтез карбапенемов контролируется парой белков CarR и CarI, гомологичных, но не идентичных по своим функциям ExpR и ExpI. CarR и ExpR не взаимозаменяемы, но АГСЛ (ацилированный гомосеринлактон), продуцируемый CarI, идентичен таковому ExpI. Продукция экзоферментов у Erwinia контролируется дополнительно еще несколькими регуляторными системами.
45.Сенсорные системы
Для бактерий (как, впрочем, и для любого другого организма) способность координировать экспрессию генов с изменениями условий окружающей среды дает существенное селективное преимущество. Адаптация бактерий к изменяющимся условиям среды контролируется белковыми системами передачи сигнала. Такие системы состоят из белковых модулей-доменов, собранных в несколько молекул, количество которых варьирует в зависимости от вида бактерии и конкретного фактора среды. Основными компонентами сенсорных систем являются:
· сенсоры (трансмембранные или цитоплазматические), детектирующие изменения окружающих условий;
· внутриклеточные посредники, получающие информацию от сенсоров и передающие ее на эффекторы;
· эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического ответа (как правило, на уровне транскрипции).
Трансмембранные рецепторы.
Механизм детекции сигнала не совсем ясен. Детектируемый сигнал может быть как вне-, так и внутриклеточным. В некоторых случаях показано, что сигнал детектируется периплазматическим доменом. Так, PhoQ - регулятор экспрессии факторов вирулентности у Salmonella typhimurium, - является сенсором дивалентных катионов, которые, связываясь непосредственно с периплазматическим доменом, стабилизируют неактивную конформацию PhoQ. Сигнал может быть внутриклеточным. Рецептор Aer, участвующий в регуляции аэротаксиса, детектирует внутриклеточный запас энергии, связываясь с FAD. Еще один пример – детекция внутриклеточной концентрации глутамина при регуляции азотного метаболизма. В ряде случаев показано, что сенсором является трансмембранный домен. Так, Cpx-путь активирован у мутантов E. coli, лишенных фосфатидилэтаноламина - таким образом, простое нарушение мембранной структуры приводит к активации этого сигнального пути. У белка EnvZ E. coli - гистидинкиназы, участвующей в осморегуляции, периплазматический домен может быть делетирован без потери сенсорной функции.
Механизм передачи сигнала.
Многие бактериальные рецепторы имеют периплазматический домен-детектор (P) и
цитоплазматический сигнальный домен (C), заякоренные в мембране двумя α-спиральными трансмембранными сегментами. Линейная структура таких белков может быть представлена как TM1–P–TM2–L–C, где L - цитоплазматический лин
|
|
|
