 |
Основные серологические реакции
|
|
|
|
Иммунохимический метод исследования в диагностике инфекционных болезней, области применения, основные реакции, принципы проведения, регистрация результатов
Иммунохимический анализ представляет собой высоко-эффективный метод выявления различных молекул, основанный на взаимодействии антиген-антитело. Он реализован в нескольких вариантах – иммуноферментном, радиоиммунном методах, реакции иммунофлюоресценции и др.
Иммуноферментный метод (иммуноферментный анализ, ИФА) - определение Аг или Ат с помощью Ат или Аг, ковалентно соединенных с ферментом (чаще пероксидазой хрена, реже - -глюкуронидазой, щелочной и кислой фосфатаза-ми). Образующийся иммунный комплекс выявляют с помощью фотометрического измерения оптической плотности окрашен-ных продуктов, которые образуются в результате ферментативно-го расщепления субстрата ферментом. Иммуноферментные реакции применяют для диагностики инфекционных болезней (СПИДа, вирусных гепатитов, хламидиоза, токсоплазмоза и др.), определения содержания гормонов, и др. Для метода характерна высокая специфичность и чувствительность; высокий уровень автоматизации создается благодаря наличию специальных анализаторов и стандартных тест-систем. Различают прямой способ, когда ферментом метят специфические Ig (Ат), и непрямой, при котором иммунный комплекс выявляют мечеными антииммуноглобулинами.
В настоящее время выпускаются тест-системы для определения антител к разным микроорганизмам. Имеются иммунофер-ментные тест-системы для выявления антител разных классов, анализ наличия которых позволяет эффективно определять фазу и стадию инфекционного заболевания, а также отличать анамнести-ческое наличие антител к возбудителю инфекции и поствакци-нальные реакции от инфекционного заболевания.
|
|
|
Иммуноферментные тест-системы для выявления антител и антигенов могут быть как качественными, так и количественными. Тест-системы для количественного определения иммунологических маркёров инфекционного заболевания помогают осуществлять мониторинг эффективности терапии и течения заболевания. Этот аспект особенно важен при исследовании динамики хронических инфекционных процессов.
Количественное определение иммунологических маркёров инфекционного заболевания реализуется в выражении количества антигенов или антител титром или концентрацией (обычно выражается в МЕ/мл или иных условных единицах). В последнем случае необходим стандартный образец, содержащий антигены или антитела (в зависимости от специализации тест-системы) в известном количестве, и используемый для изготовления калибро-вочного графика
Серологический метод исследования в диагностике инфекционных болезней, области применения, основные реакции, принципы проведения, регистрация результатов.
Серологический метод представляет собой совокупность реакций, основанных на взаимодействии антиген-антитело (см.) и направленных на выявление в сыворотке крови и других жидкостях организма антител к антигенам возбудителей инфекционных болезней, либо собственно микробных антигенов. Серологический метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью.
Учет серологических реакций осуществляют визуально, иногда с помощью лупы. Суть учета серологической реакции сводится к определению феномена связывания Аг и Ат по образованию комплекса Аг-Ат. Визуально образование комплекса Аг-Ат сопровождается двумя основным феноменами - агглютина-цией и преципитацией. Различия между ними определяются особенностями антигенов и антител, специфичных к ним
|
|
|
Основные серологические реакции
Реакция агглютинации (РА) представляет собой один из способов выявления антигена/антител по принципу нахождения известного по неизвестному. В случае нерастворимости антигена (его корпускулярности) при добавлении к нему специфичных антител происходит формирование комплекса "антиген-антитело" в виде белкового агломерата
Основные области применения РА связаны с необходимостью индентификации микробных культур, антигенов клеток крови (А,В,0), а также с определением наличия и титра антител или антигенов в сыворотке крови в практике инфекционных болезней.
Компоненты РА: 1) диагностический компонент - антиген в виде суспензии в случае поиска антител, т.е. диагностикум, или раствор антител при необходимости идентификации антигена, т.е. диагностическая сыворотка. В случае РА чаще диагностикум называют агглютиногеном, а диагностическую сыворотку - агглютинином;
2) исследуемый материал - микробная культура в виде суспензии или выросшей на скошенном агаре, клетки крови (эритроциты при определении антигенов по системе А,В,0), сыворотка крови пациента при диагностике инфекционно-го заболевания или сыворотка крови лабораторного животного при постановке биологического/иммунологического эксперимента;
3) раствор электролита в качестве среды для разведения ингредиентов реакции и в качестве среды для постановки реакции. Обычно используют 0,15 М (0,85%) раствор хлорида натрия
Регистрация результатов РА проводится по системе 4+ в процессе визуального осмотра.
Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА).. Реакция пассивной (непрямой) агглютинации проводится для регистрации взаимодействия антиген-антитело в том случае, когда антиген водорастворим и при его связывании со специфическими антителами не происходит образования крупных видимых глазом агломератов
Чаще всего для постановки РПА (РНА) применяют эритроциты барана или частицы латекса диаметром 3-5 мк
Основные области применения РПА: определение эффек-тивности поствакцинального иммунитета (определение уровня специфических антител после вакцинации), диагностика инфекционных болезней (определение титра антител или присутствия в биологических средах пациента антигенов микроорганизма, являющегося причиной заболевания), диагностика аутоиммунных заболеваний (например, определение ревматоидного фактора).
|
|
|
Схема постановки и учета РПА аналогичны РА.
Реакция связывания комплемента (РСК)., РСК применяется преимущественно для диагностики инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать специфические искомому антигену антитела и регистрировать их титр.
РСК относится к сложным многокомпонентным серологи-ческим реакциям. При постановке РСК in vitro создаются 2 системы: 1 - диагностическая, 2 - индикаторная.
1 - диагностическая система включает антиген (диагности-кум), исследуемую сыворотку крови пациента, содержащую искомые антитела и комплемент. Все три ингредиента смешива-ются в определенных пропорциях и инкубируются. Во время инкубации происходит образование комплекса антиген-антитело-комплемент в том случае, если в исследуемой сыворотке крови пациента присутствуют антитела к антигену диагностикума. При отсутствии антител комплемент остается свободным и иммунные комплексы антиген-антитело-комплемент не образуются. Внешне образование иммунных комплексов не проявляется никакими феномена вследствие особенностей взаимодействия антиген-антитело. Для индикации образования иммунных комплексов, т.е. для регистрации результатов РСК после инкубации в диагностическую систему добавляют индикационную систему.
2 - индикаторная система представляет собой суспензию эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами к ним же (гемолитическая система, приготавливаемая аналогично гемоли-тической системе для определения активности классического пути системы комплемента, см. лабораторную работу 6). Объединение двух систем и инкубация их при определенном режиме с последу-ющим центрифугированием позволяет зарегистрировать результа-ты РСК по феномену задержки гемолиза.
Учет РСК проводится по системе ++++:
- РСК - сопровождается полным гемолизом + РСК - сомнительный результат, ++++ РСК соответствует 100%-му связыванию антигена
|
|
|
