 |
2. Антирабические вакцины для инъекций
|
|
|
|
2. Антирабические вакцины для инъекций
2. 1. Общие сведения
Основная причина использования инъекционных антирабических вакцин состоит в защите здоровья человека посредством профилактики и контроля бешенства у животных, особенно у собак. Инъекции гарантируют попадание иммуногена в целевые виды. Вакцинация также используется для защиты видов и домашнего скота, находящихся под угрозой.
Живые-аттенуированные вакцины штамма Flurry (LEP или HEP) или SAD широко использовались для введения инъекций домашним животным. Однако было зарегистрировано, что несколько из этих продуктов вызывали бешенство у вакцинированных животных. Поэтому их использование в виде инъекций должно быть прекращено (Bellinger et al., 1983; Esh et al., 1982; Fehlner-Gardiner et al., 2008).
Антирабические гликопротеиновые векторные вакцины, полученные на основе биотехнологий не являются живыми антирабическими вакцинами (ВОЗ, 1996). Их готовят путем введения кода неинфекционной нуклеиновой кислоты вируса бешенства для гликопротеина вируса ящура в вектор для инъекционных вакцин, такой как авипокс. Все они не содержат живой вирус бешенства; животным, вакцинированным антирабическими гликопротеиновыми вакцинами, не должен быть запрещен доступ в страны, где есть ограничения на ввоз животных, вакцинированных живыми антирабическими вакцинами (Taylor et al., 1991). Однако штамм ERA 333, используемый в Восточной Европе, является живой антирабической вирус-вакциной, экспрессирующей гликопротеин вируса бешенства.
2. 2. Схема производства и минимальные требования к классическим вакцинам
2. 2. 1. Характеристики посевного материала
i i) Биологические характеристики
|
|
|
Любой штамм вируса бешенства, предназначенный для производства вакцин, должен защищать от любого варианта вируса бешенства филогруппы 1. Выбор расплодки вируса (MSVs) в идеале должен основываться на быстроте размножения в культуре, урожае вируса, стабильности и антигеном спектре (Wu et al., 2011). Референтные лаборатории МЭБ по бешенству могут предоставить изоляты вируса в качестве возможных кандидатов для разработки вакцин. Записи об источнике вирусной расплодки должны храниться.
Вакцины, полученные посредством применения биотехнологий, готовят в соответствующих неозлокачествленных клетотчных линиях с использованием вектора, экспрессирующего гликопротеин вируса бешенства.
ii) Критерий качества
Для приготовленияпосевного вируса для производства вакцин может быть использована только вирусная расплодка, которая была признана чистой (свободной от посторонних агентов) или иммуногенной. Если вирусная расплодка будет использоваться в качестве живой аттенуированной вакцины, то при инъекционном введении она не должна вызывать клиническую форму бешенства у целевых животных.
iii) Валидация в качестве вакцинного штамма
Вирусная расплодка должна быть охарактеризована должным образом. Она должна быть чистой и свободной от посторонних агентов в соответствии с главой 1. 1. 9 Тесты на стерильность и свободу от контаминации биологических материалов и тех, которые находятся в списке соответствующих лицензирующих учреждений.
Эффективность полученной вакцины оценивают посредством исследования каждого целевого вида, который был ранее вакцинирован в соответствии с рекомендациями главы 1. 1. 8 и Раздела С. 2. 3. 3 данной главы.
2. 2. 2. Метод производства
i) Процедуры
а) В клеточных культурах
Вирус используется с целью заражения суспензии или монослоев созданной клеточной линии. Должно быть доказано, что эта клеточная линия свободна от контаминирующих микроорганизмов (см. главу 1. 1. 8).
|
|
|
Культуры инфицируют адаптированными к культуре клеток штаммами вируса бешенства и инкубируют при соответствующей температуре в течение определенного периода времени. Так как вирус бешенства обычно не вызывает цитопатический эффект, то с той же самой культуры можно собрать несколько урожаев. Этот материал обрабатывают и используют для составления вакцины. Чтобы получить инактивированную (убитую) вакцину вирус инактивируют посредством добавления инактиванта первого порядка, обычно пропиолактона (BPL) или этиленимина (EI) в виде бинарного этиленимина (ВEI). Необходимо соблюдать меры предосторожности при работе с инактивантами. Другие инактиванты, такие как формалин и карболовая кислота использоваться не должны. Инактивант добавляется в вирусную суспензию для того, чтобы получить ранее обозначенную концентрацию. Инактивацию необходимо должным образом валидировать и документировать с тем, чтобы продемонстрировать кинетику инактивации и результаты контролей инактивации. Время обработки инактиванта и температура инактивациии должны быть валидированы с точки зрения действительных условий и оборудования, используемого во время промышленного производства.
Инактивированные антирабические вакцины обычно выпускаются в жидком или лиофилизированном виде. Наиболее часто используемую жидкую вакцину готовят путем адсорбации антигена на адъюванте, например, на геле гидроокиси алюминия.
ii) Требования к среде и субстратам
Итоговая смесь может включать пеногаситель, краситель феноловый красный (если разрешен в стране, которой нужна вакцина), гидролизат лактальбумина, триптозо-фосфатный бульон, амино кислоты, витамины и буферные соли. Сапонин или другие полисахариды могут добавлять в антирабические вакцины для жвачных в качестве адъюванта. Рекомендуется добавлять консерванты в многодозые флаконы. Перед введением лиофилизированные вакцины необходимо разводить соответствующим разбавителем.
a) В клетках
Линии клеток, используемые для производства антирабических вакцин, должны соответствовать главе 1. 1. 8.
b) В яйцах с развивающимися эмбрионами
|
|
|
Этот метод культивирования используется для производства живых аттенуированных вакцин, которые содержат вариантный штамм Flury низкого пассажа (LEP) или вариантный штамм Flury высокого пассажа (НЕР). Их использование должно быть прекращено, как указано в разделе 2. 1 выше (Tao et al., 2010; Wachendorfer et al., 1982).
iii) Контроль во время производства
Во время процесса производства перед составлением итоговой смеси тесты проводят в различное время, что позволяет верифицировать постоянство процесса производства в соответствии с главой 1. 1. 8. Тесты на инфекционность, стерильность и полноту инактивации являются существенными в контроле, осуществляемом во время производства. Составление конечного продукта может быть стандартизировано посредством использования дополнительных тестов для измерения целостности вируса после хранения, массы антигена и содержания гликопротеина.
a) Тестирование полноты инактивации
Полноту инактивации верифицируют с использованием теста на остаточное содержание живого вируса. С этой целью урожай инактивированного вируса инокулируют в такой же тип клеточной культуры, которая используется в производстве вакцины или клеточную культуру, которая, по крайней мере, обладает такой же чувствительностью. Количество используемого урожая инактивированного вируса эквивалентно не менее 25 дозам вакцины. После 4х дневной инкубации с использованием трипсинизированных клеток готовят субкультуру; после инкубации в течение последующих 4х дней культуры исследуют на остаточное количество живого вируса бешенства посредством реакции иммунофлуоресценции. Урожай инактивированного вируса считается соответствующего качества, если живой вирус не обнаружен (Государственная Фармакопея, 2012b)
iv) Тестирование конечной партии/серии продукта
После соединения всех ингредиентов итоговая смесь содержит определенный вакцинный состав. Последним этапом процесса производства партии/серии
является наполнение флаконов итоговой смесью. Эту итоговую партию/серию тестируют описанным ниже образом.
|
|
|
a) Стерильность
Тесты на стерильность и свободу от контаминации можно найти в главе 1. 1. 9.
b) Безопасность
Пока стабильная безопасность продукта не будет доказана и утверждена в регистрационном досье и пока постоянство процесса производства не будет одобрено в соответствии со стандартными требованиями, указанными в главе 1. 1. 8, должно проводиться тестирование безопасности партии.
Тестирование безопасности партии/серии конечного продукта проводится с целью обнаружения любых аномальных локальных или систематических побочных реакций. Для того, чтобы выпустить новую вакцину, каждое из, по крайней мере, двух здоровых серонегативных целевых животных инокулируют двойной дозой вакцины рекомендуемым способом. Животных наблюдают, по крайней мере, каждый день в течение 14 дней. Вакцина проходит тесты, если ни у одного из животных не наблюдается побочных реакций и ни одно животное не умирает по причине, связанной с введением вакцины (Европейская Фармокопея, 2012b).
C) Остаточное количество живого вируса.
Тест проводят с использованием пула содержимого пяти контейнеров.
Для вакцин, не содержащих адъювант, для обнаружения остаточных количеств живого вируса проводят соответствующий метод амплификации с использованием такого же типа клеточной культуры, которая используется в производстве вакцины или клеточной культуры, которая, по крайней мере, обладает такой же чувствительностью. Вакцина проходит тест, если живой вирус не был обнаружен.
Что касается вакцин, содержащих адъювант, 0, 03 мл пула, который в 5 раз превышает самую маленькую дозу, вводят итрацеребрально в каждую из не менее чем десяти мышам, каждая из которых весит 11-15 г. Чтобы предотвратить влияние любого микробиологического консерванта или адъюванта, перед инъекцией вакцину можно разводить более чем в 10 раз. В этом случае или если вакцинный штамм является патогенным для мышей-сосунков, то тест проводят на 1-4 дневных мышах. Животных наблюдают в течение 21 дня. Если в первые 48 часов умирает более двух животных, то
тест проводят повторно. Вакцина проходит тест, если с 3 по 21 день после введения инъекции, животные не проявляют признаков бешенства и в результате реакции иммунофлуоресценции, проводимой на мозге животных, признаков присутствия вируса бешенства не обнаружено.
d) Иммуногенность партии/серии
Что касается живых аттенуированных вакцин и вакцин, полученных посредством применения биотехнологии, титрация вируса является надежным показателем иммуногенности вакцины, когда между уровнем защиты, которым обеспечивает вакцина в целевых видах, и титрами модифицированной живой вакцины устанавливается связь. Титрация вируса должна выполнятся с использованием клеточных культур. Это дает возможность лабораториям действовать в соответствии с положениями Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и для других научных целей.
|
|
|
Исследование иммуногенности инактивированных вакцин осуществляется на мышах посредством серологических тестов (Kraemer et al., 2010) или контрольного теста (Европейская Фармокопея, 2012b; ВОЗ, 1996). Для инактивированных вирусных вакцин был зарегистрирован тест для идентификации возбудителя in-vitro (Stokes et al., 2012).
Нет необходимости проводить тестирование иммуногенности каждой партии/серии производимой вакцины, описанное в Разделе С. 2. 2. 2. iv. d. 1 Серологическое исследование и Разделе С. 2. 2. 2. iv. d. 2 Контрольный тест, при условии, что, по крайней мере, один из этих тестов проводили на предыдущей партии/серии и эта партия/серия отвечала минимальным требованиям к иммуногенности. В данных обстоятельствах для определения иммуногенности партии/вакцины можно применять альтернативный валидированный метод. Критерии для подтверждения устанавливаются на основании иммуногенности серии/партии вакцины, которая продемонстрировала удовлетворительные результаты при проведении серологических исследований и контрольных тестов, как описано ниже:
1) Серологическое исследование
При проведении серологических исследований опытную вакцину сравнивают со стандартной референтной вакциной посредством подсчета нейтрализующих антирабических вирусспецифических антител в мышиной сыворотке. Опытная вакцина проходит тест, если
она индуцирует больше антител, чем стандартная референтная вакцина. Тест необходимо выполнять следующим образом:
Используют пять мышей по 18-20 г. Каждую мышь вакцинируют подкожно или внутримышечно с использованием 1/5 рекомендуемого объема дозы. Через 14 дней после инъекции отбирают образцы крови. Сыворотку тестируют на антитела к вирусу бешенства с использованием теста FAVN или RFFIT (Европейская Фармакопея, 1012 b).
Вакцина отвечает требованиям, если приблизительный или средний титр антител равен или выше титра, полученного в результате тестирования партии/серии, которая продемонстрировала удовлетворительные результаты (Раздел C. 2. 2. 2. iv. d. 2: Контрольный тест).
2) Контрольный тест
При проведении контрольного теста опытную вакцину сравнивают с референтной вакциной посредством измерения уровня защиты у мышей. Опытная вакцина проходит тест, если она вызывает бò льшую защиту чем референтная вакцина.
В соответствии с Европейской Фармакопеей в описанном ниже тесте используют модель параллельных линий с, по крайней мере, тремя точками для проверки вакцины, а также референтный препарат.
i) Отбор и распределение опытных животных
В тестировании должны использоваться здоровые 4х-недельные самки мышей, предпочтительнее весом 18-20 г. из того же выводка. Мышей следует распределить, по крайней мере, на 10 групп по 10 мышей.
ii) Приготовление контрольной суспензии
Группу мышей инокулируют интрацеребрально CVS штаммом вируса бешенства; Если у мышей проявляются признаки бешенства, то их умерщвляют, извлекают мозг и в подходящем разбавителе готовят гомогенат ткани мозга. Крупные взвешенные частицы отделяют посредством центрифугирования, а супернатант используется в качестве контрольной суспензии. Суспензию в маленьких количествах разливают по ампулам, которые герметично закупоривают и
хранят при температуре < -60°C. Одну ампулу суспензии оттаивают и осуществляют серийное разведение с использованием подходящего разбавителя. Каждое разведение предназначено для группы мышей и 0, 025-0, 03 мл разведения, предназначенного для этой группы, вводят в каждую мышь интрацеребрально. Животных наблюдают, по крайней каждый день, в течение 14 дней и регистрируют количество животных каждой группы, демонстрирующих признаки бешенства в течение 5-14 дней. Далее подсчитывают среднюю инфекционную дозу (ID50) неразведенной суспензии.
iii) Определение иммуногенности тестируемой вакцины
Для проведения тестирования готовят, по крайней мере, три серийных разведения вакцины и три подобных разведения референтного препарата. Разведения готовят так, что те, которые содержат наибольшее количество вакцины должны защитить более 50% животных, в которых их вводят, а те, которые содержат наименьшее количество вакцины должны защитить менее 50% животных, в которых их вводят.
Каждое разведение предназначено для разных групп мышей и в каждую мышь внутрибрюшинно вводят 0. 5 мл разведения, предназначенного для этой группы. Суспензию контрольного вируса готовят через 14 дней после инъекции, чтобы на основании предварительной тетрации в каждых 0, 025-0, 03 мл она содержала около 50ID50. Каждой вакцинированной мыши вводят интрацеребрально 0, 025-0, 03 мл этой суспензии. Готовят три подходящих серийных разведения контрольной суспензии. Контрольная суспензия и три разведения предназначены каждой из четырех групп, состоящих из 10 невакцинированных мышей. В каждую мышь вводят 0, 025-0, 03 мл суспензии разведения, предназначенного для его группы (Strokes et al., 2012). Животных наблюдают, по крайней мере каждый день в течение 14 дней. Тест считается несостоявшимся, если в течение первых 4х дней после контрольного заражения более двух мышей из любой группы
гибнут. Количество животных каждой группы, демонстрирующих признаки бешенства в течение 5-14 дней, регистрируют.
Результаты теста считаются недействительными за исключением следующих случаев:
• • 50% защитная доза тестируемой вакцины и референтного препарата находится между самой маленькой и самой большой дозой, вводимой мышам;
• • Титрация контрольной суспензии показывает, что 0, 03 мл суспензии содержит от 10 до 50 ID50;
• • Доверительные пределы (р = 0, 95) – не менее 25% и не более 400% предполагаемой имунногенности; если данный критерий применимости не соблюдается, то в наименьшей предписанной дозе низший предел предполагаемой иммуногенности должен равняться примерно 1 МЕ;
• • Статистический анализ демонстрирует значительный уклон (р = 0, 95) и отсутствие значительных отклонений от линейности или параллелизма кривой реакции на дозу (р = 0, 99).
Вакцина отвечает требованиям МЭБ, если предполагаемая иммуногенность равна не менее 1 МЕ в наименьшей предписанной дозе.
iv) Применение альтернативных конечных точек
Если лаборатория начала использование данного теста, то летальную конечную точку заменяют наблюдением за клиническими признаками и применением конечной точки до наступления смерти с целью уменьшения страданий животных. Ниже приводится пример:
Прогрессирование инфекции бешенством у мышей после интрацеребральной инъекции может быть представлено пятью этапами в соответствии с типичными клиническими признаками:
Этап 1: взъерошенная шерсть, сгорбленная спина;
Этап 2: медленные движения, отсутствие концентрации внимания (могут наблюдаться круговые движения);
Этап 3: неуверенные движения, дрожь, конвульсии;
Этап 4: признаки пареза или паралича;
Этап 5: предсмертное состояние
Мышей наблюдают, по крайней мере два раза в день, начиная с 4го дня после контрольного заражения. При каждом наблюдении записывают клинические признаки. Опыт показал, что использование этапа 3 в качестве конечной точки позволяет получить результаты теста, которые являются эквивалентными результатам, полученным при использовании летальной конечной точки. Это должно быть верифицировано каждой лабораторией, которая оценивает соответствующее количество тестов с использованием как клинических признаков, так и летальной контрольной точки.
Тест на иммуногенность Национального Института Здоровья (NIH тест), как описано в Кодексе Федерального Регулирования США (9CFR), подобен Европейскому тесту, за исключением того, что вторая инъекция вакцины проводится через неделю после первой инъекции. Считывание и подсчет являются идентичными (Европейская фармакопея, 2012а; 9CFR, 2010).
|
|
|
