 |
1. Идентификация возбудителя. 1.1. Изоляция возбудителя. 1.2. Методы на основе иммунохимического окрашивания
|
|
|
|
1. Идентификация возбудителя
Диагностическим считается обнаружение лептоспир в крови и молоке животных с клиническими признаками острого лептоспироза. Однако выделение из крови не всегда бывает успешным, поскольку бактериемия, как правило, кратковременна и не всегда сопровождается клиническими признаками. Часто собакам перед отбором проб и тестированием на наличие Leptospira проводят лечение антибиотиками, что в дальнейшем снижает вероятность выявления возбудителя в крови. Обнаружение генерализованной лептоспирозной инфекции в ряде органов, отобранных при аутопсии, также считается диагностической. Однако если животное живет достаточно долго или получало лечение антибиотиками, обнаружение интактных организмов на системном уровне может быть затруднено, в таких случаях для обнаружения остаточного антигена лептоспир может быть задействована иммуногистохимия. Выявление лептоспир в половых путях, почках или моче следует интерпретировать только в совокупности с клиническими признаками и результатами серологических тестов, поскольку эти находки могут указывать лишь на то, что животное являлось носителем.
Отсутствие лептоспир в моче животного не исключает возможности того, что животное является хроническим носителем инфекции в почках, это лишь указывает на то, что животное на момент исследования не выделяло лептоспиры в обнаруживаемых количествах. Сбор мочи после введения животным мочегонных средств увеличивает шансы на обнаружение организмов (Nerving & Garrett, 1979). В важных случаях, когда речь идет об отдельном животном (например, лечение инфицированного жеребца-производителя с целью возобновления разведения) отрицательные результаты исследования трех проб мочи, отобранных в течение трех последовательных недель, считаются достаточным подтверждением того, что животное не выделяет лептоспиры с мочой.
|
|
|
Выявление лептоспир в жидкостях организма или во внутренних органах (обычно в почках, печени, легких, головном мозге или надпочечниках) абортированных или мертворожденных плодов является подтверждением хронического лептоспироза матери и свидетельствует об активной инфекции плода.
1. 1. Изоляция возбудителя
Для опытного специалиста выделение лептоспир – один из наиболее специфичных методов демонстрации их присутствия при условии отсутствия остатков антибиотиков, интенсивного автолиза тканей, а также немедленной обработки тканей после их отбора для проведения культивирования, а в случае с мочой – при условии поддержания соответствующего уровня рН. Если ткани или жидкости невозможно быстро транспортировать в лабораторию для посева на лептоспироз, образцы следует хранить при температуре от 2º C до 5º C во избежание чрезмерного роста других бактерий и автолиза тканей. В качестве транспортной среды для доставки образцов обычно используют жидкую культуральную среду или 1% раствор альбумина бычьей сыворотки (BSA), содержащий 5-фторурацил в концентрации 100-200 мкг/мл.
Культивирование проводят в жидкой или полутвердой (0, 1-0, 2% агара) среде, содержащей альбумин бычьей сыворотки и либо Твин 80 (например, EMJH2) (Johnson & Harris, 1967), либо комбинацию Твин 80 и Твин 40 (Ellis, 1986). Контроль контаминации осуществляют посредством добавления разнообразных селективных средств, например 5-фторурацила (Johnson & Rogers, 1964), налидиксовой кислоты (Johnson & Seiter, 1977), фосфомицина (Oie et. al, 1986) и смеси из рифамицина, полимиксина, неомицина, 5-фторурацила, бацитрацина и актидиона (Adler et. al, 1986). Однако использование селективных средств в присутствии небольшого количества жизнеспособных лептоспир может снизить шансы на выделение, а некоторые штаммы лептоспир не будут расти в селективных средах, содержащих несколько антибиотиков. Внесение 0, 4-5% кроличьей сыворотки в полутвердую культуральную среду может увеличить шансы на выделение некоторых «прихотливых» сероваров лептоспир.
|
|
|
2 EMJH: Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris
Культуры следует инкубировать при 29±1º C в течение, как минимум, 16, а лучше 26 недель (Ellis, 1986). Время, необходимое для обнаружения положительной культуры, зависит от серовара лептоспир или количества организмов, присутствующих в образце. С менее «прихотливыми» сероварами (например, Pomona и Grippotyphosa) положительные результаты можно получить уже через 7-10 дней после посева; для других сероваров (например, Hardjo и Bratislava) потребуется намного больше времени. Культуры изучают под микроскопом в темном поле каждые 1-2 недели. Важно использовать источник света мощностью 100 Ватт и темнопольный микроскоп хорошего качества.
1. 2. Методы на основе иммунохимического окрашивания
Выявление лептоспир также возможно с помощью различных методов на основе иммунохимического окрашивания, например, иммунофлуоресценции (Ellis et. al, 1982a) и различных методов иммуногистохимии (Barnett et. al., 1999; Scanziani, 1991; Wild et. al., 2002). Такие методы очень полезны для диагностики инфекции в патологическом материале, который не подходит для культивирования, или когда требуется быстро поставить диагноз. Поскольку успешность этих методов зависит от количества организмов, присутствующих в образцах, они меньше подходят для диагностирования состояния хронического носительства, при котором количество организмов может быть очень небольшим или обнаруживаемым только в определенных органах. Лептоспиры плохо окрашиваются анилиновыми
красителями, а методы окрашивания серебром обладают недостаточной чувствительностью и специфичностью, хотя они являются полезным дополнением к методам гистопатологической диагностики (Baskerville, 1986).
|
|
|
