 |
Database : NCBInr 20140220 (36984152 sequences; 13075283088 residues)
|
|
|
|
ЗАКЛЮЧЕНИЕ СПЕЦИАЛИСТА
по результатам химического исследования
| №07-10/16 | от «20» октября 2016 г. |
«17» октября 2016 г., 11 час. 00 мин.
(дата, время начала производства исследования)
«20» октября 2016 г., 18 час. 00 мин.
(дата, время окончания производства исследования)
г. Москва
(место производства исследования)
Основание производства исследования:
Запрос №07-10/16 от 07 октября 2016 г.
Специалист, выполнивший исследование:
Топилин Сергей Васильевич
ВВОДНАЯ ЧАСТЬ.
I. «07» октября 2016 года в ООО «Центр химических исследований» поступил запрос на проведение химического исследования.
II. При запросе на исследование представлены материалы:
Образец лекарственного препарата «NANOTROP», дата производства 2016-06, срок годности 2018-06, номер партии 0000225.
III. На разрешение специалиста поставлен следующийвопрос:
1. Определение подлинности представленного на исследование соматропина;
2. Определение содержания родственных белков;
3. Количественное определение содержания белка (соматропина).
IV. Проведение исследования поручено Топилину Сергею Васильевичу.
Сведения о специалисте: химик – судебный эксперт, имеющий высшее химическое образование (Диплом Ростовского государственного университета ДВС №0886528, 2001 г), сертифицирован в качестве негосударственного судебного эксперта (Сертификат соответствия №003558 Палаты судебных экспертов по специальности: «Основы судебной экспертизы», 2012г.), свидетельство о повышении квалификации по программе «Повышение квалификации специалистов, ответственных за качество, упаковку и маркировку лекарственных средств, в т.ч. уполномоченных лиц», прошедшему стажировку на кафедре организации производства и реализации лекарственных средств фармацевтического факультета Первого Московского государственного медицинского университета имени И. М. Сеченова, стаж работы по специальности – 14 лет.
|
|
|
V. Сведения об экспертном учреждении:
5. Сведения об организации:
Общество с ограниченной ответственностью «Центр химических исследований» (ООО «ЦХИ») зарегистрировано в установленном порядке. Свидетельство о государственной регистрации организации выдано Межрайонной инспекцией Федеральной налоговой службы №46 по г. Москве Москве (ОГРН 1137746231314).
ООО «Центр химических исследований» осуществляет деятельность на основании Устава и действующего законодательства Российской Федерации. Проведение химических исследований (экспертиз) является уставной деятельностью организации.
ООО «Центр химических исследований» сертифицировано в соответствии с требованиями ГОСТ ISO9001-2011(ISO9001:2008, IDT) «Система менеджмента качества. Требования». Срок действия с 31 августа 2015 г. по 30 августа 2018 г.
Юридический адрес: 115172, г. Москва, ул. М. Каменщики, д. 18, стр. 16
Телефон: 8(499)390-40-13. Интернет-сайт: центр-химических-исследований.рф. Адрес электронной почты: [email protected]
VI. Перечень оборудования:
· ВЭЖХ / хроматомасс спектрометр Agilent 1200 Series;
· УФ-ВИД Спектрофотометр Varian «Сагу-100»;
· Весы лабораторные OhausRV313;
· pH-метр METROHM «827 pH lab»;
· MALDI-времяпролетный масс-спектрометр UltrafleXtreme BRUKER (Германия).
VI. Перечень использованной литературы:
При исследовании и разработке методик использовались методы, изложенные в следующей специальной литературе:
1. База данных Mascot, www.matrixscience.com;
2. USP 29 Monograph. Somatropin.
ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ ЧАСТЬ
Соматропин (гормон роста человека) - одноцепочечный полипептид, состоящий из 191 аминокислотного остатка. Имеет следующее химическое строение:
Эмпирическая формула соматропина: C990H1528N262O300S7. Молекулярная масса: 22125Да.
|
|
|
Исследование по вопросу 1: Определение подлинности представленного на исследование соматропина.
Для подтверждения подлинности соматропина исследуемый объект сравнивался по такому параметру, как время удерживания, со стандартным (эталонным) образцом соматропина, который исследовался ранее с целью подтверждения его подлинности методом трипсического гидролиза и последующего анализа полученных продуктов гидролиза (пептидов) методом MALDI c последующим поиском полученных молекулярных масс в базе данных Mascot.
Триптический гидролиз: К 2 мкл раствора белка прибавляли 10 мкл раствора модифицированного трипсина (Promega) с концентрацией 25 мкг/мл в 0.05 М NH4HCO3. Гидролиз проводили в течение 30 мин при 37°С, затем к раствору добавляли 7 мкл 0.5 % ТФУ в 50 % растворе водного ацетонитрила и тщательно перемешивали. Раствор использовали для получения MALDI-масс-спектров.
Подготовка образцов для масс-спектрометрии. На мишени смешивали по 2 мкл раствора образца и 0.5 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich,10 мг/мл в 20 % водном ацетонитриле, 0,5% ТФУ), полученную смесь высушивали на воздухе.
Масс-спектры были получены на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре UltrafleХtreme BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных моноизотопных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0.007 % (70 ррм). Спектры получали в диапазоне масс 500-4500 m/z, выбирая мощность лазера оптимальную для достижения наилучшего разрешения.
Идентификация белка. Осуществляли при помощи программы Mascot. Масс-спектры были обработаны с помощью программного пакета FlexAnalysis 3.3 (Bruker Daltonics, Германия). При помощи программы Mascot (опция «пептидный фингерпринт») провели поиск в базе данных NCBI среди белков всех организмов с указанной выше точностью, с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха. Кандидатные белки, имеющие параметр достоверности score >88 в базе данных NCBI считали определенными надежно (p<0.05).
Результаты анализа. Согласно поиску по базе данных, стандартный (эталонный) образец представляет собой заявленный гормон роста человека (191 аминокислота массой 22125 Да) без примесей других белков. Структура белка набирается полностью.
|
|
|
Препарат исследуемого образца сравнивали со стандартным (эталонным) образцом в нижеприведенных условиях хротографирования (определение содержания родственных белков), было обнаружено, что оба образца имеют одинаковое время удерживания и масс-спектр, что свидетельствует о том, что данный препарат идентичен стандартному (эталонному) образцу по своему составу.
Исследование по вопросу 2: Определение содержания родственных белков.
Определение проводили методом обращеннофазовой ВЭЖХ.Из флакона отбирали 20 мкл имеющегося раствора. Перед началом определения хроматографическую колонку промывали 0,1% раствором трифторуксусной кислоты в 50% растворе ацетонитрила. Условия хроматографирования. Колонка из нержавеющей стали Reprosil-Pur Basic-C18- 250 х 4,6 мм, заполненная суперчистым силикагелем‚ с диаметром пор 100 ангстрем, «Nanotrop» размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза градиент – фаза А: H2O + 0,01% трифторуксусной кислоты, B: ацетонитрил + 0,01% трифторуксусной кислоты). Детектор УФ 220 нм. Скорость подвижной фазы 0,5 мл/мин. Объем вводимой пробы 20 мкл. Температура термостата колонки – 45 оС.Результаты анализа. Чистота образца «Nanotrop» по данным УФ и ELSD – детекторов составила 98,4%.
Исследование по вопросу 3: Количественное определение содержания белка (соматропина).
Для определения содержания белка в образце готовили 0,025 М раствор одноосновного калия фосфата, доводя pH гидроокисью натрия до 7,0. Образец количественно переносили в мерную колбу на 5 мл и доводили до метки приготовленным буферным раствором.
Измеряли оптическую плотность при длинах волн 280нм и 320 нм и длине оптического пути 1 см против раствора сравнения (буферный раствор). Расчет проводили по формуле [2]:
V(А280 – А320)/0,82
Полученное количество общего белка равняется для образца «Nanotrop» – 3,3306 мг на флакон.
ВЫВОД
По результатам проведенного исследования специалист приходит к следующему заключению:
По вопросу 1: Определение подлинности представленного на исследование соматропина.
Представленный на исследование препарат содержит в своем составе заявленный гормон роста человека – соматропин.
|
|
|
По вопросу 2: Определение содержания родственных белков.
Чистота представленного на исследование препарата составляет 98,4%.
По вопросу 3: Количественное определение содержания белка (соматропина).
Количественное содержание соматропина в препарате составляет 3,3306 мг на флакон.
Специалист С.В. Топилин
Приложения:
Приложение 1. Внешний вид образца.
Приложение 2. Масс-спектр трипсического гидролизата выделенного белка стандартного (эталонного) образца.
Приложение 3. Хроматограммы с УФ, ELSD и масс-детекторами стандартного (эталонного) образца соматропина.
Приложение 4. Хроматограммы с УФ и ELSD и масс-детекторами исследуемого образца.
Приложение 5. Копии документов, подтверждающих компетенцию специалиста.
Приложение 6. Сертификаты соответствия экспертного учреждения.
Приложения.
Приложение 1. Внешний вид образца.
Приложение 2. Масс-спектр трипсического гидролизата выделенного белка стандартного (эталонного) образца.
Сопоставление стандартного (эталонного) образца с базой данных Маscot.
Mascot Search Results
Database: NCBInr 20140220 (36984152 sequences; 13075283088 residues)
|
|
|
