Реакция с применением меченых антител и антигенов; реакция иммунофлюоресценции, ИФА, радиоиммунный анализ.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция Кунса. Это метод экспресс-диагностики. Для постановки РИФ применяются иммунные сыворотки, меченные флюорохромными красителями, например, изоти-оцианатом флюоресцеина. Флюорохромы вступают в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их специфичности.

Прямой метод РИФ. Из исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена (например, холерного вибриона), гото­вят препарат-мазок и обрабатывают его флюоресцирующей сыворот­кой, содержащей антитела к данному антигену (в нашем случае - про­тивохолерной сывороткой). При микроскопии в люминесцентном мик­роскопе наблюдают светящиеся микробы.

Недостатком прямого метода РИФ является необходимость иметь боль­шой набор флюоресцирующих сывороток против каждого антигена.

Непрямой метод РИФ. Препарат-мазок обрабатывают иммунной кроличьей антисывороткой к антигену (противохолерной кроличьей сывороткой), а затем - флюоресцирующей антиглобулиновой сыворот­кой, содержащей антитела против глобулинов кролика. Затем наблю­дают в люминесцентном микроскопе светящиеся микробы.

При использовании этого метода можно иметь одну флюоресци­рующую сыворотку против глобулинов кролика.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Как и другие реакции иммуни­тета, ИФА используется 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворот­ке крови больного с помощью известного антигена. Особенность реак­ции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом, и его присутствие определяется с помощью субстрата, который при дей­ствии фермента окрашивается.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА.

1) Обнаружение ан­тигена (рис. 20). Первый этап - адсорбция специ­фических антител на твердой фазе, в качестве которой используют по­листироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пла­стиковых панелей.

Второй этап - добав­ление исследуемого ма­териала, в котором пред­полагается наличие ан­тигена. Антиген связы­вается с антителами. После этого луночки промывают.

Третий этап - добав­ление специфической сы­воротки, содержащей антитела против данно­го антигена, меченые ферментом. В качестве

фермента используют пероксидазу или щелочную фосфатазу. Мече­ные антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом ма­териале антигена на поверхности твердой фазы образуется комплекс антитело-антнген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилдиамин в смеси с Н2О2 в буферном растворе. При действии фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску, ин­тенсивность которой позволяет количественно определить результаты опыта фотометрированием.

2) Обнаружение антител (рис. 21). Первый этап - адсорбция специ­фических антигенов на стенках лунки. Обычно в коммерческих систе­мах антигены уже адсорбированы на поверхности твердой фазы - в лунках или на пластиковых шариках.

Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитела.

Третий этап - после отмывания лунок добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против глобулинов человека), меченные ферментом.

Результаты реакции учитывают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положи­тельные и заведомо отрицательные.

Разрабатываются "безреагентные" системы для ИФА, в которых все компоненты реакции со­единены с поверхностью полимера. Для проведе­ния анализа необходимо внести исследуемый мате­риал и наблюдать измене­ние окраски.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в час­тности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепати­тах.

Иммуноблоттинг - это вариант ИФА, сочетание электрофореза и ИФА. Методом электрофореза в геле, содержащем фермен­ты, разделяют биополиме­ры, например, антигены вируса иммунодефицита человека.

 

Реакции иммунного лизиса; реакция гемолиза и бактериолиза, реакция локального гемолиза в геле Ерне, РСК.

Реакции иммунного лизиса

Антиген (эритроциты или бактерии), соединившись со специфи­ческими антителами, образует иммунный комплекс, к которому при­соединяется комплемент (С1), и происходит активация комплемента по классическому пути. Активированный комплемент лизирует эрит­роциты (гемолиз) или бактерии (бактериолиз). Реакция бактериолиза применяется для идентификации холерного вибриона.

Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, ан­титела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритро­цитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - «лако­вую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для об­наружения комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант ре­акции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.

Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют ком­племент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, об­разуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в пер­вой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой пред­полагают наличие антител, и добавляют комплемент, инкубируют в термостате 30 минут или 18-20 часов в холодильнике.

Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты ба­рана + гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.

При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с ан­тигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрицательная (антител в исследуемой сыворотке нет), комплемент останется свобод­ным, и произойдет гемолиз.

РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, го­нореи, сыпного тифа и других заболеваний.

РСК можно применять и для определения антигена, например, ви­руса. В этом случае в качестве антител применяется диагностическая иммунная сыворотка.

В качестве комплемента для РСК применяется сыворотка крови морской свинки. Гемолитическую сыворотку получают из крови кро­ликов, иммунизированных эритроцитами барана.

 

⇐ Предыдущая11121314151617181920Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: