Вопрос 3. Методы получения чистой кльтуры

Это основной метод выделения чистых культур мо, предложенный Р. Кохом. Принцип- получение чистой культуры из отдельной колонии. Однако этот метод неприменим для выделения мо, которые не растут или плохо растут на плотных средах(некоторые бактерии, многие водоросли и простейшие).

При выделении чистой культуры аэробов накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды. Порядок работы следующий. Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную питательную среду, содержащую агар или жела­тину, разливают в стерильные чашки Петри. Когда сре­да застынет, на ее поверхность из пипетки наносят каплю нако­пительной культуры или ее разведения в стерильной воде и сте­рильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют кап­лю сначала по одной половине поверхности среды в чашке Петри,затем по второй половине, после чего этим же шпателем протира­ют поверхность плотной среды последовательно во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюда­ют сплошной рост мо,а в последующих — изолированные колонии. Рассевать накопительную к­-ру можно петлей методом истощающего штриха. В этом случае накопительную к-ру или ее разведение отбирают петлей и на поверхности.плотной среды проводят штрихи в таком порядке, как указано на рис. Перед каждым новым штрихом петлю стери­лизуют в пламени горелки.

После посева чашки помещают в термостат крышками вниз,чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри при застывании агара, не помешала получить изолирован­ные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1—7 суток в зависимости от скорости роста мо. Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность ско­шенной плотной среды в пробирки или в жидкую среду.

Изолированные колонии аэротолерантных мо и факультативных анаэробов чаще получают методом глубинного досева. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15—20 мл и стерилизуют. Непосредст­венно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную ба­ню, чтобы среда расплавилась. Высев проводят из разведений на­коп-ой к-ры в стерильной водопроводной воде. Разведе­ния готовят с таким расчетом, чтобы при высеве 0,5—1,0 мл раз­ведения получить изолированные колонии. Степень разведения оп­ределяется плотностью на­коп-ой к-ры. Высевы делают, как правило, из 3-4х последних разведений. Для этого в пробирку с расплавленной и остуженной до 48—50°агаризованной средой вносят 0,5—1,0 мл одного из разведений накопительной культуры. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки выни­мают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени го­релки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашку Петри. После того как агаризованная среда застынет, чашки Петри по­мещают в термостат. Колонии, выросшие в толще среды, выреза­ют стерильным скальпелем или извлекают стерильными капил­лярными трубками или просто петлей и переносят в жидкую сре­ду.

Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев проводят на по­верхность среды в чашки Петри, но после посева чашки тотчас помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом раз­ведения -разведения накоп-ой к-ры проводят в расплавленной и охлажденной до 45—50° агаризованной питательной среде. Делают 6—10 последо­вательных разведений. Затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (3:1), что препятствует про­никновению воздуха в толщу агаризованной среды.

Иногда агаризаванную питательную среду после посева и тща­тельного перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри. Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение накопительной культуры в расплавленной агаризованной питательной среде. Конец капилля­ра запаивают. При удачно выбранном разведении накопительной культуры в одной из пробирок (пипеток Пастера, трубок Бурри) вырастают изолированные колонии. И звлечение образовавшихся колоний - а)удаляют стериль­ной иглой слой парафина и вазелинового масла, а столбик агаризованной среды выдувают из пробирки в стериль­ную чашку Петри, пропуская газ, не содержащий кислорода, че­рез капилляр, который помещают между стенкой пробирки и агаризованной средой. Агаризованную среду из трубки Буррл выду­вают, пропуская газ через ватную пробку.

б)робир­ку слегка нагревают, все время быстро вращая ее над пламенем горелки. При этом агар, непосредственно прилегающий к стенке, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика лег­ко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара раз­резают стерильным ланцетом и извлекают колонии, захватывая их стерильными капиллярными трубками или петлей. Можно также вырезать их стерильным ланцетом. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции поверхности его разламывают стерильным пинцетом и уча­стки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.

Для получения изолированных колоний ме­тодом глубинного посева и методом разведений рекомендуется использовать осветленные пита­тельные среды.