Активная кислотность среды

Активная кислотность (рН) среды имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растут при рН, близком к 7,0, напротив, микроскопические грибы предпочитают слабокислые среды. Поэтому в приготовлен­ных средах всегда следует определить значение рН. Измеряют рН электрометрическим методом на потенциометре. В лаборатор­ной практике удобно использовать различные жидкие или бумаж­ные индикаторы (см. Приложение). Широко применяется, напри­мер, жидкий двухцветный индикатор, бромтимоловый сииий (бромтимолблау). Его цвет изменяется от желтого к синему при сдвиге рН от 6,0 до 7,6. При рН 7,3 индикатор имеет сине-зеленую окраску. Используют также универсальный индикатор, который изменяет окраску в интервале рН от 2 до 10.

В случае необходимости рН сред доводят до нужного значения растворами кислот (НС1, Н₂50₄), щелочей (ЫаОН, КОН) или со­лей, имеющих щелочную реакцию (№₂СОз, N311003). Для кор­ректировки рН целесообразно иметь растворы разной концентра­ции. Значение рН сред может измениться в процессе стерилизации, поэтому после стерилизации его следует проверить и довести до нужного, если это требуется, стерильными растворами кислоты или щелочи.

Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе куль­тивирования микроорганизмов. Эти изменения могут быть резуль­татом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Например, при сбра­живании углеводов в среде накапливаются органические кислоты, снижающие рН среды. В средах с КЬЮз рН возрастает, как уже отмечалось, благодаря более интенсивному потреблению нитрат-иона и накоплению ионов калия.

Чтобы не допустить чрезмерного изменения рН в культурах микроорганизмов и удержать его на необходимом уровне, исполь­зуют различные приемы. Иногда в среды добавляют буферные растворы. В микробиологической практике чаще других применяют фосфатные буферы. Однако если рост мик­роорганизмов сопровождается образованием большого количества кислот, то тех количеств буферного раствора, которые можно до­бавлять к средам (не более 5 г фосфатов на 1 л среды), оказыва­ется недостаточно, так как противодействие любого буфера изме­нению рН не беспредельно. Поэтому для микроорганизмов, актив­но изменяющих кислотность среды, применение буферов, неэф­фективно. При культивировании таких микроорганизмов в среды вводят избыточное количество мела, который нейтрализует обра­зующиеся кислоты. Можно нейтрализовать образующиеся кисло­ты по ходу развития культуры 10%-ным стерильным раствором ЫаНСОз.

Поддержание определенного значения рН во время роста осо­бенно важно для тех микроорганизмов, которые образуют в про­цессе жизнедеятельности кислоты, но не обладают устойчивостью к ним. К их числу относятся молочнокислые бактерии, а также мно­гие псевдомонады. Большие затруднения встречаются, когда нуж­но поддерживать рН в слабощелочных средах, так как для диапа­зона рН от 7,2 до 8,5 подходящих буферов не существует. Поэтому иногда приходится периодически или непрерывно доводить рН до нужной величины, добавляя стерильно в среду растворы кислоты или щелочи при постоянном контроле значения рН. В современ­ных ферментерах это достигается с помощью специальных авто­матических устройств.

Аэрация

Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки всегда в больших количествах. Однако значи­тельная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода. Такие микроорганизмы принято объ­единять в группу облигатных аэробов. Энергетическим процессом, у них является аэробное дыхание, а молекулярный кислород игра­ет роль терминального окислителя. Среди облигатных аэробов вы­деляют группу микроаэрофильных микроорганизмов, которые нуждаются в кислороде, но лучше растут при парциальном давле­нии Ог«меньшем, чем в воздухе. Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода. Получение энергии у этих микроорганизмов не связано с использованием молекулярного кислорода. Для многих из них кислород токси­чен — он угнетает рост или вызывает гибель клеток. Такие мик­роорганизмы называют облигатными анаэробами. Среди микроор­ганизмов выделяют также группу факультативных анаэробов, представители которой способны расти как в присутствии, так и в отсутствие молекулярного кислорода. Например, некоторые дрож­жи иди энтеробактерии в зависимости от наличия кислорода осу­ществляют аэробное дыхание или брожение.

Вопрос 3. Строение клеточной мембраны, окраска по Граму.

Датский ученый Грам в 1884 г. предложил метод дифференциации микробных клеток, основанный на раз­личии в химическом составе клеточных оболочек. Сущ* ность метода заключается в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем, у дру­гих видов это соединение появляется временно и послеобработки спиртом растворяется. Первые микроорганиз­мы называются грамположительными, вторые — грам-отрицательными.

Техника окраски по Граму. На хорошо обезжирен­ное предметное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них — контрольные с заведомо известным отношением к окраске по Граму). Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламе­нем горелки и окрашивают в течение 1 мин феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллическо­го фиолетового), держа стекло в несколько наклонном положении. Сливают краситель и, не промывая препа­рат водой, наносят на него раствор Люголя на 1 мин (до полного почернения мазка). Стекло и в этом случае лучше держать в наклонном положении. Препарат (не промывая водой) обрабатывают, непрерывно покачивая, 96%-ным спиртом в течение 15—20 с. Время обесцвечи­вания очень существенно, при превышении определен­ного срока обесцвечиваются и грамположительные клет­ки, при недостаточном сроке обработки препарат ока­жется перекрашенным в дальнейшем.

Промыв препарат водой, его окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1 мин. Грамположительные мик­роорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные — имеют только цвет дополнитель­ной окраски (фуксина).

Результаты окраски по Граму зависят от возраста культуры. В старых культурах мертвые клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Некоторые бактерии (коринебактерии, протей) окрашиваются грамвариа-бельно (часть клеток как грамположительные, а часть— как грамотрицательные).

В качестве объектов для окраски клеток микроорга­низмов по Граму рекомендуются дрожжи, Bacillus mesentericus или Bacillus subtilis (грамположительные) и кишечная палочка Escherichia coli (грамотрицатель-ная).

Метод Грама в модификации Синева. На фиксиро­ванный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги шириной 3 см, предварительно пропитанную 1%-ным спиртовым раствором кристаллического фио­летового и высушенную (в высушенном виде бумага мо­жет долго храниться). На бумагу наносят 2—3 капли воды и оставляют ее на препарате 2 мин.

В дальнейшем окраску проводят по вышеописанной методике. Модификация Синева нашла широкое приме­нение в практике.

Метод Грама в модификации Калины. На предмет­ное стекло наносят небольшую каплю дистиллированной воды, вносят в нее минимальное количество клеток мик­роорганизмов и петлей добавляют 0,5%-ный спиртовой раствор кристаллического фиолетового. Суспензию рав­номерно распределяют на площади 1 см², подсушивают и фиксируют однократным проведением над пламенем Горелки. После этого препарат в течение 1 мин обра­батывают реактивом, содержащим 10 мл 5%-ного раст­вора фуксина Пфейфера, 10 мл 10%-ного раствора йода, 10 мл ацетона и 70 мл 0,5%-ного раствора йодис­того калия. Затем препарат опускают на одно мгнове­ние в этиловый спирт (96%-<ный) и быстро высушивают фильтровальной бумагой.\