Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Диагностика вирусных болезней картофеля.




 

Для диагностики вирусных болезней применяются макро- и микроскопические, биологические, физические, химические, индикаторный и серологический методы. Наиболее распространены визуальный и серологический методы.

Визуальный метод – определение заболевания по внешним признакам (хлороз, деформации, чрезмерное ветвление, язвы, некрозы, мозаики) непосредственно в поле (скручивание листьев, полосчатая мозаика,бактериоз стеблей, бурая бактериальная гниль, аукуба – мозаика, морщинистая мозаика, столбур). Этот метод часто не дает надежных результатов при определении вирусов Х,S,M,A, вызывающих слабозаметные симптомы или находящихся в латентном состоянии.

Эффективность визуального метода оценки выше, если учитывать комплекс основных и второстепенных признаков в динамике. Например, слабые признаки обыкновенной мозаики лучше заметны на молодых растениях до цветения, затем они ослабевают или исчезают; закручивание листьев сильно проявляется во время бутонизации, позднее исчезает; признаки полосчатой мозаики проявляются после цветения и усиливаются с возрастом растений.

Наиболее типичные проявления вирусной инфекции на картофеле - мозаики, деформации, хлорозы, некрозы, желтая мозаика.

При тяжелых формах вирусных болезней отмечаются следующие признаки.

Для морщинистой мозаики (вирус У, часто – вместе с вирусами Х,S и А) характерны мозаичность и морщинистость листьев, торможение роста жилок долей в длину, края листьев загибаются книзу, на листьях – некрозы, нижние листья засыхают.

При полосчатой мозаике (чаще вирус У) обнаруживаются темные штрихи (некрозы) и пятна на нижней стороне листа, а также на черешках листьев и стеблях.

При закручивании листьев (вирус М) проявляются мозаичность, искривления и волнистость верхних листьев, края их долей загнуты вверх или доли слегка сложены вдоль средней жилки. Признаки болезни хорошо различаются только на молодых растениях.

Складчатая мозаика (вирус А) характеризуется разнообразными деформациями долей листа, часто сопровождающимися мозаичностью.

К группе желтух относится скручивание листьев (вирус L): нижние листья скручиваются в трубочки, становятся жесткими и шуршат, что особенно заметно во время цветения.

Крапчатость и обыкновенная мозаика (вирусы Х и S) проявляются на листьях в виде размытых светлых пятен различной величины, иногда наблюдается слабая деформация листьев.

Для выявления поражения картофельного растения вирусом скручивания листьев применим гистохимический анализ (выявляются патологические изменения в структуре клеток и тканей, биохимическом составе растений). Во флоэме стебля отмечается отмирание клеток (некроз), а в ситовидных трубках клубней – накопление полисахарида каллозы, выявляемое по окрашиванию тканей фуксином и резорцином.

Серологический метод – выявление скрытой инфекции с помощью диагностических сывороток. Основан на антигенных свойствах вирусов: при смешивании диагностических сывороток с соком проверяемых растений, листьев, клубней, ростков, вытяжек из них, семян в случае их зараженности одним или несколькими вирусами наблюдается хлопьевидный осадок. Метод широко применяется в первичном семеноводстве и селекции картофеля. Дает возможность выявить растения, зараженные латентными формами вирусов Х,S, М,У,А и скручивания листьев. Оптимальные сроки анализа для вирусов Х и М – во время бутонизации, вируса У – через 20-25 суток после всходов, вируса S – во время цветения. Серологическую оценку рекомендуется проводить не менее 2х раз. Для этого у полевых растений отбирают концевые доли 3-х полностью развитых листьев (верхнего, среднего и нижнего) и выдерживают при t 3-50 С не менее 2 ч, а при анализе растений, полученных из глазков в теплице, берут 2-3 листа целиком с верхней частью стебля. Для получения более достоверных серологических реакций следует: химические обработки посевов, подлежащих проверке, прекращать за 2-3 недели до начала анализов; проверять только молодые растения; отбирать листья с разных ярусов; брать сок из свежесорванных листьев; между отжатием сока и смешиванием его с сывороткой не допускать перерыва более 30 мин; анализы проводить при t 18…220 C; смешанные капли выдерживать не менее 20 мин.

Разновидность этого метода – иммуноферментный анализ, основанный на использовании сывороток, глобулины которых соединены с ферментом (Элиза – тест). Вначале материал проверяют с помощью капельного серологического, индикаторного и других методов и только после этого для окончательной проверки используют данный метод.

Сущность иммуноферментного анализа заключается в следующем: на стадии выделения иммуноглобулинов добавляют небольшое количество фермента пероксидазы или кислой фосфатазы, что позволяет резко повысить чувствительность метода благодаря цветной реакции. При этом дается не только качественная характеристика, но и количественная. В настоящее время освоены методы получения конъюгата (иммуноглобулины, меченые указанными выше ферментами) для выявления вирусов Х,У, S, М.

Среди модификаций ИФА предпочтение отдается Сэндвич – методу. Им можно одновременно определить растения на зараженность Х,S, М,У, F,L – вирусами.

Оборудование для ИФА: автоматические пипетки от 50 до 200 мкл, полистироловые пластины с 96 лунками; фотометр, холодильник на -200 С, термостат на +370 С, сушильный шкаф, диагностические наборы на вирусы, которые заказывают в НИИКХ. Анализ проводят при t 18…250 С. Весь процесс определения длится 1,5 дня и состоит из следующих этапов:

1. Нанесение антител. Специфические антитела разбавляют в буфере и наливают по 100 мкл (0,1 мл) в лунки платы, накрывают крышкой и инкубируют в течение ночи при + 40 или 2 часа при + 370 С в термостате.

Промывка. Раствор удаляют из платы. Для этого нужно резко перевернуть плату и вытряхнуть содержимое. Промывают лунки 3 раза промывочным буфером. Избыточную влагу удаляют из лунок фильтровальной бумагой.

2. Нанесение анализируемых образцов. Буфером экстрагируют сок из растения картофеля и наливают по 0,1 мл суспензии исследуемого материала, а также контрольные растворы в лунки платы. Закрывают плату крышкой и инкубируют в течение ночи при + 40С или 1 ч при + 370 С.

В качестве отрицательного контроля используют сок листьев или ростков заведомо здоровых растений и клубней или вносят в лунку вместо него буфер для проб и коньюгата в объеме не больше 0,1 мл (во избежание появления неспецифической реакции).

Приготовление образцов. Анализировать можно листовой материал (пробирочные растения) или ростки клубней (1-2 см). Измельченную ткань или выжатый сок надо разбавить буфером для проб и коньюгата в отношении «вес:объем» или «объем: объем» – 1:5 – 1:10 на 0,1 мл буфера.

При взятии проб необходима тщательная промывка проточной водой инструментов и посуды с последующей дезинфекцией.

3. Нанесение коньюгата. Наливают в лунки по 0,1 мл рабочего раствора коньюгата (специфическое антитело, меченое ферментом), накрывают плату крышкой, инкубируют 1 ч при +370 С. Промывку проводят аналогично п.1.

4. Проведение ферментативной реакции. Наливают по 0,1 мл субстрата и инкубируют при комнатной t0 в течение 30…40 мин для окрашивания.

Оценка результатов. Наличие или отсутствие вируса может быть определено визуально или спектрофотометрически. При визуальной оценке, дающей информацию типа “да” “или нет”, интенсивность окраски в лунках с анализируемыми пробами сравнивают с интенсивностью окраски в лунках с отрицательным контролем. Результаты анализа можно фиксировать условными обозначениями: - - вирус отсутствует; + - материал заражен; ++ - материал сильно заражен.

Антитела, нанесенные на планшет и высушенные на воздухе, рекомендуется хранить при – 200 С. В этих условиях они в течение нескольких месяцев не теряют способности взаимодействовать с вирусом.

Контроль пробирочных растений методом Элиза – теста (ИФА) осуществляют при черенковании растений.

 

Метод электронной микроскропии. Объект, приготовленный для просмотра на электронном микроскопе, должен быть монтирован на очень тонких (толщиной 20 нм) пленках формваровых или коллодиевых.

Для получения пленки готовый коллодий дополнительно высушивают в вакууме и растворяют в амилацетате (1-1,5 % раствор).

На сетки (диски 3 мм с отверстиями, изготовленные из меди) наносят плёнку.

Для нанесения объекта на сетку с пленкой готовят предметное стекло с наклеенной тонкой полоской пластыря посередине, по обе стороны которого по краям слегка прикрепляют по 10 сеток с пленкой.

Край исследуемого листа отрезают лезвием и место среза погружают на 1-2 сек. в каплю дистиллированной воды, помещенную на сетку с пленкой. Каждый новый срез делают чистым лезвием. После высыхания и напыления препарат готов для просмотра.

Контрастирование напылением производят в вакуумной установке. Для достоверности готовят по два препарата исследуемого объекта и просматривают по 10 полей каждого препарата. Для напыления применяют металлы. Препараты просматривают при увеличении в 40-60 тыс. раз.

Метод индексации. Для выявления вирусных болезней в зимний период применяют метод индексации, т.е. определение зараженности клубней вирусами по их частям (индексам). Он основан на способности некоторых вирусов давать внешнее проявление заболевания за короткое время в условиях повышенной температуры. Для чего в зимний период после естественного начала прорастания клубней или искусственного прерывания периода покоя путем обработки стимуляторами в верхушечной части клубня вырезают глазок (индекс) вместе с мякотью диаметром до 1,5 см. Индексы высаживают в горшочки с торфокрошкой и выращивают из них растения в условиях теплиц. При этом номер каждого глазка (индекса) такой, как у клона, из которого взят клубень для проведения анализа.

При высоте растений 18-20 см растения тщательно осматривают на выявление внешних признаков заболеваний. Все больные растения бракуют и записывают в журнал их номера. Внешне здоровые проверяют на выявление скрытой инфекции серологическим или иммуноферментным методами. При анализе растений, полученных из глазков в теплице, берут целиком 2-3 листа с верхней части стебля. Все растения с положительной реакцией бракуют, а их номера отмечают в журнале. По данным визуальной и серологической оценок растений, выращенных из глазков (индексов), проводят браковку клонов. По результатам оценки бракуют целиком все клоны, номера которых совпадают с номерами выбракованных растений в теплице.

 

Задания для самостоятельной работы.

1. Ознакомиться с методикой и техникой визуальной диагностики вирусных болезней, учитываемых в семеноводстве картофеля, и получить практические навыки.

2. Ознакомиться с методикой и техникой проведения анализов по диагностике болезней в скрытой форме и получить практические навыки.

3. Получить практические навыки по освоению методов иммуноферментного анализа и метода индексации.

 

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...