 |
В) барботажно-эрлифтный: 1 – корпус, 2 – диффузор-теплообменник, 3 – воздухораспределитель
|
|
|
|
Известны следующие основные типы аппаратов отечественного производства: барботажный (трубчатый и коробчатый), эрлифтный (типовой), эрлифтно-периферийный, эрлифтно-многозонный, многозонной конструкции, колонный, горизонтальный с самовсасывающими мешалками, эжекционный, дрожжерастильный и другие. Из зарубежных моделей известны аппараты фирм «Лефрансуа» (Франция), «Хепос» (Чехия) и «Уде-Хекс» (Германия), концернов «ICI» и «БП» (Великобритания), колонный аппарат фирм «Мицубиси» (Япония) и «Ликвихимик биосинтез» (Италия), струйный аппарат «ИЦ» (Германия), аппарат системы «Фогельбуша» (Австрия), шаровой аппарат фирмы «Хемап» (Швейцария) и другие.
Большинство перемешиваемых и аэрируемых культур во время роста образуют довольно много пены. Образование на поверхности среды культивирования слоя из пузырьков связано с наличием в среде поверхностно-активных веществ (ПАВ), Умеренное пенообразование способствует росту многих аэробных микроорганизмов (пенный слой – кислородный коктейль).
Особое внимание уделяется борьбе с избыточным пенообразованием, так как, если не препятствовать этому, пена смачивает фильтры для стерилизации воздуха, что приводит к контаминации культуры посторонней микрофлорой, уменьшению полезного объема биореактора, а также выходу пены наружу.
Контроль пенообразования осуществляется путем введения в сосуд специального датчика.
Для борьбы с избыточным пенообразованием используется механическое и химическое пеногашение. При механическом пеногашении лопасти пеногасителя размещаются на валу мешалки. При химическом пеногашении в крышке сосуда предусматривается специальный ввод для реагента гашения.
|
|
|
Химические пеногасители более дешевы, их используют время от времени при необходимости подавления пенообразования. Однако при добавлении этих веществ может изменяться состав питательной среды.
Пеногасящие вещества растительного (кукурузное, касторовое, соевое, подсолнечное масло, масло из семян хлопчатника и другие) и животного (свиной, говяжий, бараний, китовый и другие жиры) происхождения могут служить микроорганизмам источником углерода и энергии и, следовательно, стимулировать их активное развитие. Однако известны случаи, когда природные пеногасители оказывали отрицательное действие на метаболизм клетки.
А такие неметаболизируемые пеногасители, как силиконы, в высокой концентрации токсичны.
Поэтому пеногасители, являющиеся поверхностно-активными веществами, следует использовать только в очень низких концентрациях и только после тщательной проверки. Пеногасители добавляют непосредственно в среду перед стерилизацией или в ферментер через специальный ввод.
Аппараты для анаэробных процессов достаточно просты и применяются в процессах конверсии растительного сырья, а также различных промышленных отходов.
При метановом брожении для получения биогаза, а также в ряде других процессов (получение ацетона, шампанских вин) используют ферментационные аппараты (метанотенки).
Эти аппараты имеют различную конструкцию (от простой выгребной ямы до сложных металлических конструкций или железобетонных сооружений) и объемы (от нескольких до сотен кубометров). Метанотенки оборудованы системой подачи сырья, системой теплообменных труб для стабилизации температуры, несложным перемешивающим устройством для гомогенного распределения сырья и биомассы продуцента, газовым колпаком и устройством переменного объема (газгольдер) для сбора образуемого биогаза.
КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ПОСУДА
Для культивирования клеток обычно используют флаконы, колбы, матрасы, чашки Петри, платы, роллерные сосуды, пробирки, пипетки и т. д.
|
|
|
Посуда из стекла
В последние годы посуда из стекла не утратила своего значения, благодаря ряду бесспорных преимуществ:
хорошие адгезионные свойства поверхности;
многократность использования;
биологическая инертность стекла ряда составов;
термостойкость и другие.
Кроме того, в экспериментах с контролируемым уровнем кислорода необходимо пользоваться именно стеклянной посудой, т. к. в пластике кислород может растворяться. Помимо этого из пластика могут экстрагироваться водорастворимые органические соединения.
Для стеклянной лабораторной посуды на практике в основном применяются два типа составов – многощелочное и малощелочное. Щелочесодержащие силикатные стекла имеют недостаточную термостойкость и химическую устойчивость к воде, кислотам и щелочам. Алюмоборосиликатные малощелочные стекла типа «Пирекс» характеризуются высокой устойчивостью к воде, устойчивостью к щелочным растворам и ко всем кислотам за исключением плавиковой (фтористоводородной) и горячей фосфорной. Кроме того стекла типа «Пирекс» обладают хорошими оптическими свойствами.
Однако успех в эксперименте обеспечивается не только качеством стекла, но и степенью подготовки лабораторной посуды. Посуда для культивирования должна быть чистой физически, химически и биологически.
Пластиковая посуда
Начиная с 1965 года, все большее применение в лабораторной практике находит пластиковая посуда одноразового использования. Такая посуда проста в использовании, т. к. выпускается в стерильном, готовом к работе виде. Стерилизация производится в процессе изготовления физическими (облучение УФ светом или гамма лучами) или химическими (газы – окись этилена, жидкости – этиловый спирт, раствор пергидроля) способами.
Пластиковая посуда производится в двух модификациях – для культивирования микроорганизмов и для культивирования клеток.
Протопласты растительных клеток как объекты биологического конструирования
Способы выделения растительных протопластов
Протопласты растений – это клетки, лишенные целлюлозной оболочки, т.е. ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды и характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм и выполнять биосинтезы и трансформацию энергии.
|
|
|
Термин был использован Д. Ханстеином (Ганштейном) в 1880 г. для обозначения морфологически обособленных образований при плазмолизе.
Впервые выделение растительных протопластов было осуществлено в 1892 г. Дж. Клеркером при изучении плазмолиза в клетках водного телореза (Stratiotes aloides) при механическом повреждении ткани.
Данный способ выделения протопластов получил название «механический».
Механические методы получения растительных протопластов являются наиболее простыми, но длительными и трудоемкими. При этом фрагмент растительной ткани вносят в 0,1 М раствор сахарозы, более концентрированный, чем вакуолярный сок, выдерживают определенное время до тех пор, пока протопласты не сожмутся и не отойдут от клеточных стенок, а затем аккуратно рассекают эпидермис, и протопласты выходят в среду. Однако при применении даже модифицированных механических методов, можно получить только ограниченное число протопластов, и, в этом случае, можно использовать только те ткани, в которых возможен экстенсивный плазмолиз (получить протопласты из меристемы или зрелой ткани очень сложно). Метод трудоемкий и длительный.
Принципиально отличающийся метод получения изолированных протопластов - энзиматический. В этом случае для удаления клеточной стенки используются гидролитические ферменты. Изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментов впервые было успешно осуществлено Е.Кокингом в 1960 г. (после того, как Салтон успешно получил бактериальные протопласты под действием лизоцима в 1952 г.). Он удачно применил ферментный препарат из культуральной жидкости гриба Myrothecium verrucaria для получения больших количеств изолированных протопластов из кончиков корней томатов.
В сравнении с механическим методом ферментативное выделение протопластов имеет определенные преимущества:
|
|
|
одновременно можно получить большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или массы клеток),
протопласты не подвергаются сильному осмотическому сжатию,
клетки более интактны и не повреждены,
метод сравнительно быстрый.
Оптимальные условия для выделения протопластов очень индивидуальны для разных тканей. В каждом случае необходима предварительная работа по подбору состава ферментов, их концентрации и соотношения, а также продолжительности обработки клетки и ткани ферментами. Выделяющиеся протопласты должны находиться в контакте с ферментом минимальное время и затем тщательно отмыты от них. Стерилизацию раствора ферментов производят через бактериальные фильтры.
Для удаления клеточной стенки обычно используются ферментные препараты трех типов - целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы – чаще всего грибного или бактериального происхождения.
Выбор ферментной системы (комбинация ферментов и их соотношение) производится на основании знаний об особенностях растительных тканей.
Время выделения протопластов зависит от концентрации ферментов. При высоких концентрациях - продолжительность составляет 1-4 часа, при невысоких – 12-20 часов. Инкубация с ферментами в колбах осуществляется при медленном круговом вращении.
Важное значение имеют осмотические свойства среды выделения, собственно как и среды культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки.
Неправильный выбор осмотических агентов может привести к разрыву плазмалеммы и лизису протопластов или к спонтанному их слиянию, сопровождающемуся образованием многоядерных клеток.
В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, сахарозу маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl). Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.
Оптимальными для выделения протопластов являются 0,1-0,8 М растворы стабилизаторов осмотического давления.
В качестве осмотически активных веществ чаще используют сахара. При этом маннит предпочтительнее, чем сорбит, т.к. он обладает слабой проникающей способностью. Проникновение в клетки сорбита может сопровождаться проникновением гидролитических ферментов, чего следует избегать. Возможно, применение смеси сорбита и маннита. Глюкоза и сахароза активно проникают через мембрану, однако их обычно используют при получении протопластов, поскольку их растворы создают условия, близкие к условиям культивирования клеток.
|
|
|
Для некоторых тканей применение растворов сахаров не дает желаемых результатов. В этом случае в качестве регуляторов осмотического давления используют растворы солей. Однако необходимо помнить, что соли обладают более высокой проникающей способностью, чем сахара, и могут снижать активность некоторых гидролитических ферментов. Растворы солей часто используют в качестве основы при действии других осмотически активных веществ.
Условия изолирования: рН среды 5,4 - 6,2, температура от +14 (пшеница) до +28 оС (томат), в темноте или при невысокой освещенности (не более 2000 лк).
В результате обработки тканей ферментными препаратами образуется смесь, содержащая протопласты, обломки разрушенных клеток и целые клетки. Чтобы отделить протопласты от примесей, суспензию либо фильтруют через нейлоновые фильтры, а затем центрифугируют в мягких условиях, либо подвергают флотации.
Источником клеток для получения протопластов помимо фрагментов растительных тканей являются также клеточные суспензии и каллусные культуры. Схема общей процедуры изоляции протопластов та же, однако, в этом случае нет необходимости в стерилизации исходного материала.
Выделение протопластов достаточно легко выполнимая и технически хорошо отработанная процедура, однако получить жизнеспособные протопласты непросто и также непросто их в дальнейшем культивировать.
Успех процесса зависит от многих факторов – состава ферментов, их качества, рН среды, выбора осмотического раствора. Большое значение при этом имеет состояние растительного материала, а именно, его видовая, генетическая, энергетическая и физиологическая характеристики, а также применяемые методы получения и культивирования протопластов.
Для стабильного получения большого количества протопластов важны стандартные условия выращивания исходных растений или клеток, определение оптимального для выделения протопластов возраста растения или органа, температуры, освещения, питания.
Для получения протопластов из суспензионных и каллусных культур наилучшей является поздняя логарифмическая фаза роста, когда клеточные стенки лучше всего поддаются ферментативному разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны.
Однако существенным неудобством применения культивируемых клеток как исходного материала для выделения протопластов состоит в том, что такие культуры часто имеют нестабильное число хромосом. Большинство долго культивируемых линий содержат смесь эуплоидных и анэуплоидных клеток (последние обычно не способны к регенерации растений). Это приводит к существенному снижению частоты регенерации растений из изолированных протопластов.
Эванс и коллеги в 1982-3 гг. (Evans Е., Gamborg О., 1982; Evans Е., Bravo J., 1983) разработали метод, формирующий хромосомную стабильность в используемых для изоляции протопластов клеточных культурах. В качестве определяющих факторов они указали три:
Важен эксплантат, который используется для получения клеточной культуры. Например, ткани листа или ткани молодых побегов имеют более высокое содержание диплоидных клеток, чем ткани сердцевины.
На число хромосом культивируемых клеток влияет концентрация регуляторов роста. Так, высокие концентрации кинетина способствуют возникновению полиплоидии.
Для полученной диплоидной культуры важно поддерживать селективные условия, которые благоприятствовали бы доминированию данной популяции.
Протопласты, изолированные из стабильной клеточной культуры, с большей вероятностью регенерируют растения и более полезны для исследования генетической модификации протопластов, особенно их слияния.
Чтобы получить жизнеспособные протопласты в ряде случаев применяют предшествующую подготовку материала, например, выдерживают растительную ткань в темноте в течение нескольких часов в присутствии осмотиков, чтобы вызвать предварительный плазмолиз и сократить время инкубации в ферменте.
Иногда растение на некоторое время помещают в темноту или на короткое время на яркий свет.
Для успешного выделения протопластов из Nicotiana tabacum оптимальными являются следующие условия выращивания растений: температура 22 °С, освещенность 10 000-20 000 лк в течение 15 ч, еженедельная подкормка азотом. Наиболее благоприятный возраст растения 40-60 сут.
Выделение протопластов из листа:
Главные отличия методики при работе с листьями заключаются в том, что листовая ткань освобождается от эпидермиса.
Стандартная методика выделения протопластов (по Такебе) из мезофильных тканей листа Nicotiana tabacum: Полностью сформировавшийся лист отделяют от здорового растения в возрасте 20-80 дн, промывают проточной водой, затем ополаскивают дистиллированной; на 0,5-1 минуту окунают в 70%-ный этанол и помещают после этого на 15-20 мин в 10%-ный раствор гипохлорита кальция (или на 3-5 минут в 5% раствор). Затем лист несколько раз промывают в стерильной дистиллированной воде, подсушивают и помещают на фильтровальную бумагу нижним эпидермисом вверх. Осторожно с помощью скальпеля и глазного пинцета снимают эпидермис, разрезают на небольшие фрагменты площадью примерно 2-4 см2 и помещают в раствор фермента, так, чтобы ткань плавала на поверхности фермента и не тонула, при этом та часть листа, с которой удален эпидермис, должна контактировать с ферментным раствором. Из очищенной от эпидермиса листовой ткани протопласты извлекаются двухступенчатой энзиматической обработкой. На первом этапе используют раствор пектиназы, который осуществляет мацерацию ткани, и затем, на втором этапе, клетки обрабатывают целлюлазой, окончательно разрушающей целлюлозные клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей.
Вместо последовательного воздействия пектиназой и целлюлазой растительные клетки можно одновременно обрабатывать смесью этих ферментов – одноступенчатая энзиматическая обработка (J. Power, Е. Cocking, 1969). Для этого листовую ткань без эпидермиса помещают непосредственно в ферментативную смесь, содержащую 0,5% раствор пектиназы и 2% раствор целлюлазы в 0,7 М растворе сорбита или маннита.
Данная смесь ферментных препаратов эффективна, однако не всегда. В некоторых случаях добавление пектиназы ингибирует выделение протопластов. Успешно применяется в этих целях целлюлозно-пектиновый препарат – ксиланаза (2,0-5,0%). Он включает эндоксиланазу, ксилозидазу, эндоглюканазу, целлобиазу, эндополигалактуроназу, пектинэстеразу и протеазу. Хорошую активность имеет и целлокондин, дополнительно содержащий фермент целлюлазного комплекса.
Обработку листовой ткани раствором ферментов удобнее проводить в чашках Петри. После инкубации фрагменты листа осторожно перемешивают стерильным пинцетом, передвигая кусочки в одну сторону. Чашку Петри при этом держат под углом 15°. Энзиматическую смесь с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация.
При фильтрации смесь пропускают через нейлоновые фильтры с размерами пор 40-60 мкм. На фильтре при этом остаются агрегаты клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании профильтрованной водной фазы при 100-400 об/мин в течение 3-5 мин оседают протопласты, а осколки клеток остаются в супернатанте. К осадку добавляют раствор регулятора осмотического давления. При повторном центрифугировании идет отмывка протопластов от фермента. Отмывают дважды. Отбирают раствор осмотика и добавляют несколько мл питательной среды (Мурасиге-Скуга). В камере Фукса-Розенталя определяют число протопластов в мл, исходную суспензию разводят средой так, чтобы конечное число клеток составляло 1-4х104 на 1 мл, и по 2 мл разливают в чашки и культивируют в темноте при 25 оС.
Метод очистки фильтрацией очень эффективен. Но для ослабленных протопластов этап фильтрации часто бывает слишком груб.
Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 г. и предназначается для ослабленных хрупких протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной неочищенной смеси добавляют раствор сахарозы или сорбита (концентрацией от 0,3 до 0,6 М) и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.
Протопласты клеток табака
Протопласт клетки мха
|
|
|
