Синтетический период. Самоудвоение ДНК

Синтетический (S) период характеризуется удвоением (репликацией) молекул ДНК, а также синтезом белков, в первую очередь гистонов. Последние, поступая в ядро, участвуют в упаковке вновь синтезированной ДНК в нуклеосомную нить. Одновременно с удвоением количества ДНК происходит удвоение числа центриолей.

Способность ДНК к самовоспроизводству (самоудвоению) обеспечивает размножение живых организмов, развитие многоклеточного организма из оплодотворённой яйцеклетки, передачу наследственной информации из поколения в поколение. Процесс самовоспроизведения ДНК часто называют репликацией (редупликацией) ДНК.

Как известно, генетическая информация записана в цепи ДНК в виде последовательности нуклеотидных остатков, содержащих одно из четырёх гетероциклических оснований: аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и тимин (Т). Предложенная Дж. Уотсоном и Ф. Криком в 1953 году модель строения ДНК в форме регулярной двойной спирали (рис. 29) позволила выяснить принцип удвоения ДНК. Информационное содержание обеих цепей ДНК идентично, так как каждая из них содержит последовательность нуклеотидов, строго соответствующую последовательности другой цепи. Это соответствие достигается благодаря наличию водородных связей между направленными навстречу друг другу основаниями двух цепей: Г-Ц или А-Т. Нетрудно представить, что удвоение ДНК происходит вследствие того, что цепи расходятся, а потом каждая цепь служит матрицей, на которой собирается комплементарная ей новая цепь ДНК. В результате образуются две дочерние двуспиральные, неотличимые по строению от материнской ДНК, молекулы. Каждая из них состоит из одной цепи исходной материнской молекулы ДНК и одной вновь синтезированной цепи (рис. 30). Такой механизм репликации ДНК, при котором от одного поколения к другому передаётся одна из двух цепей, составляющих материнскую молекулу ДНК, экспериментально доказан в 1958 году М. Мезельсоном и Ф. Сталем и получил название полуконсервативного. Синтез ДНК, наряду с этим, характеризуется также антипараллельностью и униполярностью. Каждая цепь ДНК имеет определённую ориентацию: один конец несёт гидроксильную группу (ОН), присоединённую к 3´-углероду (С₃) в дезоксирибозе, на другом конце цепи находится остаток фосфорной кислоты в 5´ (С₅) положении дезоксирибозы (рис. 30). Цепи одной молекулы ДНК различаются ориентировкой молекул дезоксирибозы: напротив 3´ (С₃) конца одной цепи находится 5´ (С₅) конец молекулы другой цепи.

 

 

Рис. 30. Схема структуры ДНК Комплементарность взаимодействия (АТ и ГЦ) позволяет понять, почему две дочерние спирали (А, Б) имеют точно такую же нуклеотидную последовательность, как и исходная материнская (В) спираль

 

 

ДНК-полимеразы. Ферменты, синтезирующие новые цепи ДНК, называются ДНК-полимеразами. Впервые ДНК-полимеразу обнаружил и описал у кишечной палочки А. Корнберг (1957). Затем ДНК-полимеразы выявили и в других организмах. Субстратами всех этих ферментов служат дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ), полимеризующиеся на одноцепочечной ДНК-матрице. ДНК-полимеразы последовательно наращивают цепь ДНК, шаг за шагом присоединяя к ней следующие звенья в направлении от 5´- к 3´-концу, причём выбор очередного нуклеотида определяется матрицей.

В клетках обычно присутствует несколько типов ДНК-полимераз, выполняющих различные функции и имеющих разное строение: они могут быть построены из различного (1-10) количества белковых цепей (субъединиц). Однако все они функционируют при любых последовательностях нуклеотидов матрицы, выполняя одну и ту же задачу - сборку точной копии матрицы. Синтез комплементарных цепей всегда ведётся униполярно, т.е. в 5´→3´ направлении. Поэтому в процессе репликации одновременный синтез новых цепей идёт антипараллельно. В отдельных случаях ДНК-полимеразы могут давать «задний ход», передвигаясь в направлении 3´→5´. Это происходит тогда, когда последнее добавленное при синтезе нуклеотидное звено оказалось некомплементарным нуклеотиду матричной цепи. При «заднем ходе» ДНК-полимеразы оно замещается комплементарным нуклеотидом. Отщепив несоответствующий принципу комплементарности нуклеотид, ДНК-полимераза продолжает синтез в 5´→3´ направлении. Такая способность к исправлению ошибок получила название корректорской функции фермента.

Точность репликации. Несмотря на огромные размеры, генетичес­кий материал живых организмов реплицируется с высокой точностью. В среднем в процессе воспроизведения генома млекопитающего, состоящего из ДНК длиной 3 млрд. пар нуклеотидов, возникает не более трёх ошибок. При этом ДНК синтезируется чрезвычайно быстро (скорость её полимеризации колеблется в пределах от 500 нуклеотидов в секунду у бактерий до
50 нуклеотидов в секунду у млекопитающих). Высокая точность репликации, наряду с её высокой скоростью, обеспечивается наличием специальных механизмов, устраняющих ошибки. Суть такого механизма коррекции заключается в том, что ДНК-полимеразы дважды проверяют соответствие каждого нуклеотида матрице: один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь синтезируется лишь в том случае, если последний (3´-концевой) нуклеотид растущей цепи ДНК образовал правильную (комплементарную) пару с соответствующим нуклеотидом матрицы. Если же на предыдущей стадии реакции произошло ошибочное соединение оснований, то дальнейшая полимеризация останавливается до тех пор, пока такое несоответствие не будет устранено. Для этого фермент перемещается в обратном направлении и вырезает последнее добавленное звено, после чего его место может занять правильный нуклеотид-предшественник. Следовательно, многие ДНК-полимеразы обладают, помимо 5´- 3´- синтетической активности, ещё и 3´-гидролизирующей активностью, которая обеспечивает удаление некомплементарных матрице нуклеотидов.

Инициация цепей ДНК. ДНК-полимеразы не могут начинать синтез ДНК на матрице, а способны только добавлять новые дезоксирибонуклеотидные звенья к 3´-концу уже имеющейся полинуклеотидной цепи. Такую заранее образованную цепь, к которой добавляются нуклеотиды, называют затравкой. Короткую РНК-затравку синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов фермент ДНК-праймаза. Праймазной активностью может обладать либо отдельный фермент, либо одна из субъединиц ДНК-полимеразы. Затравка, синтезированная этим ферментом, отличается от остальной новосинтезированной цепи ДНК, поскольку состоит из рибонуклеотидов.

Размер рибонуклеотидной затравки (до 20 нуклеотидов) невелик в сравнении с размером цепи ДНК, образуемой ДНК-полимеразой. Выполнившая свою функцию РНК-затравка удаляется специальным ферментом, а образованная при этом брешь ликвидируется ДНК-полимеразой, использующей в качестве затравки 3´-ОН-конец соседнего фрагмента ДНК. Удаление крайних РНК-праймеров, комплементарных 3´-концам обеих цепей линейной материнской молекулы ДНК, приводит к тому, что дочерние цепи оказываются на 10-20 нуклеотидов короче (у разных видов размер РНК-затравок различен). В этом заключается так называемая проблема «недорепликации концов линейных молекул». В случае репликации кольцевых бактериальных ДНК этой проблемы не существует, так как первые по времени образования РНК-затравки удаляются ферментом, который
одновременно заполняет образующуюся брешь путём наращивания
3´-ОН-конца растущей цепи ДНК, направленной в «хвост» удаляемому праймеру. Проблема недорепликации 3´-концов линейных молекул ДНК решена у эукариот с участием фермента теломеразы.

Функции теломеразы. Теломераза (ДНК-нуклеотидилэкзотранс­фераза, или теломерная терминальная трансфераза) была обнаружена в 1985 году у равноресничной инфузории, а впоследствии - в дрожжах, растениях и животных. Теломераза достраивает 3´-концы линейных молекул ДНК хромосом короткими (из 6-8 нуклеотидов) повторяющимися последовательностями (у позвоночных ТТАГГГ). Помимо белковой части теломераза содержит РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК повторами. Наличие в молекуле РНК последовательности, определяющей матричный синтез отрезка цепи ДНК, позволяет отнести теломеразу к обратным транскриптазам, т.е. ферментам, способным вести синтез ДНК по матрице РНК.

В результате укорочения после каждой репликации дочерних цепей ДНК на размер первого РНК-праймера (10-20 нуклеотидов) образуются выступающие однонитевые 3´-концы материнских цепей. Они узнаются теломеразой, которая последовательно наращивает материнские цепи (у человека на сотни повторов), используя их 3´-ОН-концы в качестве затравок, а входящую в состав фермента РНК - в качестве матрицы. Образующиеся длинные одноцепочечные концы, в свою очередь, служат матрицами для синтеза дочерних цепей по обычному принципу комплементарности.

Постепенное укорочение ДНК клеточного ядра во время репликации послужило основанием для разработки одной из теорий «старения» клеток в ряду поколений (в клеточной колонии). Так, в 1971 году А.М. Оловников в своей теории маргинотомии предположил, что укорочение ДНК может ограничивать потенциал деления клеток. Это явление может рассматриваться, по мнению российского учёного, в качестве одного из объяснений установленного в начале 60-х годов ХХ века «лимита Хайфлика». Суть последнего, названного по имени автора - американского учёного Леонардо Хайфлика, заключается в следующем: клетки характеризуются ограничением возможного количества делений. В его опытах, в частности, клетки, взятые у новорождённых детей, делились в культуре тканей 80-90 раз, в то время как соматические клетки от 70-летних людей - только 20-30 раз.

Этапы и механизм репликации ДНК. Расплетание молекулы ДНК. Поскольку синтез дочерней цепи ДНК происходит на одноцепочечной матрице, ему должно предшествовать обязательное временное раз-
деление двух цепей ДНК (рис. 30). Исследования, проведённые в начале
60-х годов на реплицирующихся хромосомах, позволили выявить особую, чётко ограниченную область репликации (местного расхождения двух её цепей), перемещающуюся вдоль родительской спирали ДНК. Эта область, в которой ДНК-полимеразы синтезируют дочерние молекулы ДНК, из-за своей Y-образной формы была названа репликационной вилкой. С помощью электронного микроскопирования реплицирующейся ДНК удалось установить, что реплицированная область имеет вид глазка внутри нереплицированной ДНК. Репликационный глазок образуется только в местах нахождения специфических нуклеотидных последовательностей. Эти последовательности, получившие название точек начала репликации, состоят приблизительно из 300 нуклеотидов. Последовательное движение репликационной вилки приводит к расширению глазка.

Двойная спираль ДНК весьма стабильна: для того, чтобы она расплеталась, необходимы особые белки. Специальные ферменты ДНК-хелика­зы, используя энергию гидролиза АТФ, быстро перемещаются по одиночной цепи ДНК. Встречая на пути участок двойной спирали, они разрушают водородные связи между основаниями, разделяют цепи и продвигают репликационную вилку. Вслед за этим с одиночными цепями ДНК связываются специальные дестабилизирующие спираль белки, которые не позволяют одиночным цепям ДНК сомкнуться. При этом они не закрывают оснований ДНК, оставляя их доступными для последующего соединения с комплементарными основаниями.

В связи с тем, что комплементарные цепи ДНК закручены в спираль, для того, чтобы репликационная вилка могла продвигаться вперёд, неудвоенная часть ДНК должна очень быстро вращаться. Эта топологическая проблема решена путём образования в спирали своеобразных «шарниров», позволяющих цепям ДНК раскручиваться. Особые белки, называемые ДНК-топоизомеразами, вносят в цепь ДНК одно- или двухцепочечные разрывы, позволяющие цепям ДНК разделиться, а затем ликвидируют эти разрывы. Топоизомеразы участвуют также в расцеплении зацепленных двухцепочечных колец, образующихся при репликации кольцевых двухцепочечных ДНК. С помощью этих ферментов двойная спираль ДНК в клетке может принимать «недокрученную» форму с меньшим числом витков, что облегчает расхождение двух цепей ДНК в репликационной вилке.

Прерывистый синтез ДНК. Репликация ДНК предполагает, что по мере перемещения репликационной вилки будет происходить непрерывное прирастание нуклеотид за нуклеотидом обеих новых (дочерних) цепей. При этом, поскольку две цепи в спирали ДНК антипараллельны, одна из дочерних цепей должна была бы расти в направлении 5´-3´, а другая - в направлении 3´-5´. В действительности, однако, оказалось, что дочерние цепи растут только в направлении 5´-3´, т.е. всегда удлиняется 3´-конец затравки. Это, на первый взгляд, противоречит уже отмеченному факту, что движение репликационной вилки, сопровождающееся одновременным считыванием двух антипараллельных нитей, осуществляется в одном направлении. Однако в действительности синтез ДНК происходит непрерывно толь-
ко на одной из матричных цепей. На второй матричной цепи ДНК
синтезируется сравнительно короткими фрагментами (длиной от 100 до
1000 нуклеотидов в зависимости от вида), названными по имени обнаружившего их учёного фрагментами Оказаки. Вновь образованная цепь, которая синтезируется непрерывно, названа ведущей, а другая, собираемая из фрагментов Оказаки - отстающей цепью. Синтез каждого из этих фрагментов начинается с РНК-затравки. Через некоторое время РНК-затравки удаляются, бреши застраиваются ДНК-полимеразой и фрагменты сшиваются в одну непрерывную цепь специальным фрагментом ДНК-лигазой.

Взаимодействие белков и ферментов репликационной вилки. Из вышеизложенного может создаться впечатление, что отдельные белки функционируют в репликации независимо друг от друга. В действительности большая часть этих белков объединена в комплекс, быстро продвигающийся вдоль ДНК и согласованно с высокой точностью осуществляющий процесс репликации. Этот комплекс сравнивают с крошечной «швейной машиной»: его «деталями» служат отдельные белки, а источником энергии - реакция гидролиза нуклеозидтрифосфатов. Спираль ДНК расплетается ДНК-хеликазой. Этому процессу помогают ДНК-топоизомераза, раскручивающая цепи ДНК, и множество молекул дестабилизирующего белка, связывающихся с обеими одиночными цепями ДНК. В области вилки на ведущей и отстающей цепях действуют две ДНК-полимеразы. На ведущей цепи ДНК-полимераза работает непрерывно, а на отстающей фермент время от времени прерывает и вновь возобновляет свою работу, используя короткие РНК-затравки, синтезируемые ДНК-праймазой. Молекула ДНК-праймазы непосредственно связана с ДНК-хеликазой, образуя структуру, называемую праймосомой. Праймосома движется в направлении раскрывания репликационной вилки и по ходу движения синтезирует РНК-затравку для фрагментов Оказаки. В этом же направлении движется ДНК-полимераза ведущей цепи и, хотя на первый взгляд это трудно представить - ДНК-полимераза отстающей цепи. Для этого, как полагают, последняя накладывает цепь ДНК, которая служит ей матрицей, саму на себя, что и обеспечивает разворот ДНК-полимеразы отстающей цепи на 180 градусов. Согласованное движение двух ДНК-полимераз обеспечивает координированную репликацию обеих нитей. Таким образом, в репликационной вилке одновременно работают около двадцати разных белков (из которых упомянута только часть), осуществляя сложный, высокоупорядоченный и энергоёмкий процесс репликации ДНК.

Согласованность механизмов репликации ДНК и клеточного деления. В эукариотической клетке перед каждым делением должны синтезироваться копии всех её хромосом. Репликация ДНК эукариотической хромосомы осуществляется посредством разделения хромосомы на множество отдельных репликонов. Такие репликоны активируются не одновременно, однако клеточному делению должна предшествовать обязательная однократная репликация каждого из них. Как оказалось, по хромосоме эукариот в каждый момент времени может перемещаться независимо друг от друга множество репликационных вилок. Остановка продвижения вилки происходит только при столкновении с другой вилкой, движущейся в противоположном направлении, или по достижении конца хромосомы. В результате в короткий срок вся ДНК хромосомы оказывается реплицированной. При этом блоки конденсированного гетерохроматина, в том числе участки ДНК вблизи центромеры, реплицируются в самом конце S-периода, как и неактивная Х-хромосома млекопитающих, конденсированная (в отличие от активной Х-хромосомы) целиком в гетерохроматин. Вероятнее всего первыми реплицируются те области кариотипа, в которых хроматин наименее конденсирован, а следовательно, наиболее доступен для белков и ферментов репликационной вилки. После упаковки молекулы ДНК хромосомными белками каждая пара хромосом в процессе митоза упорядоченно разделяется между дочерними клетками.

Премитотический период

Премитотический (постсинтетический, G₂) период начинается по завершении синтетического периода и продолжается до наступления митоза (рис. 27). Он включает процессы непосредственной подготовки клетки к делению: запасание энергии в АТФ, созревание центриолей, синтез иРНК и белков (в первую очередь тубулина). Продолжительность премитотического периода составляет 2-4 часа (10-20% длительности жизненного цикла). Переход клетки из G₂-периода в G₀-период, по мнению большинства учёных, невозможен.

Вступление клетки в митоз контролируется двумя факторами:
М-задерживающий фактор препятствует вступлению клетки в митоз до завершения репликации ДНК, а М-стимулирующий фактор индуцирует митотическое деление клетки в присутствии белков-циклинов, которые синтезируются на протяжении всего жизненного цикла клетки и распадаются в ходе митоза.

Митотический период

Митотический период характеризуется протеканием митотического (непрямого) деления клетки, включающего деление ядра (кариокинез) и разделение цитоплазмы (цитокинез). Митоз, занимающий 5-10% времени жизненного цикла и продолжающийся, например, в животной клетке 1-2 часа, подразделяется на четыре основные фазы (рис. 27): профазу, метафазу, анафазу и телофазу.

Профаза является самой продолжительной фазой митоза. Она начинается процессом конденсации хромосом (рис. 31), которые обретают, при рассмотрении в световой микроскоп, вид тёмных нитевидных образований. При этом каждая хромосома состоит из двух хроматид, расположенных параллельно и соединенных между собой в области центромеры. Одновременно с конденсацией хромосом происходит диспергация, или распыление ядрышек, которые перестают быть видимыми в световой микроскоп, что связано с вхождением ядрышковых организаторов в состав различных пар хромосом. Соответствующие гены, кодирующие р-РНК, инактивируются.

С середины профазы начинает разрушаться кариолемма, распадаясь на фрагменты, а затем на мелкие мембранные пузырьки. Гранулярная эндоплазматическая сеть распадается на короткие цистерны и вакуоли, на мембранах которых резко уменьшается количество рибосом. Примерно на четверть уменьшается число полисом, локализованных как на мембранах, так и в гиалоплазме клетки. Такие изменения приводят к резкому падению уровня синтеза белка в делящейся клетке.

Важнейшим процессом профазы является формирование митотического веретена. Репродуцировавшиеся ещё в S-периоде центриоли начинают расходиться к противоположным концам клетки, где впоследствии сформируются полюсы веретена. К каждому полюсу перемещается диплосома (две центриоли). Одновременно формируются микротрубочки, отходящие от одной центриоли каждой диплосомы (рис. 32). Формирующееся в результате этого образование имеет в животной клетке веретеновидную форму, в связи с чем получило название «веретена деления» клетки. Оно состоит из трёх зон: двух зон центросфер с центриолями внутри них и

Рис. 31. Митотический период жизненного цикла клетки: 1 – клетка в премитотическом периоде; 2 – профаза (начало); 3 – профаза (окончание); 4 – метафаза; 5 – анафаза; 6 – телофаза

Рис. 32. Схема формирования веретена деления в профазе митоза

располагающейся между ними зоны нитей веретена деления. Все три зоны содержат большое количество микротрубочек. Последние входят в состав центросфер, располагаясь вокруг центриолей, формируют нити ве ре­тена, а также подходят к центромерам хромосом (рис. 33). Микро­трубочки, тянущиеся от одного полюса к другому (не прикрепляющиеся к центромерам хромосом), получили название полюсных микротрубочек. Микротрубочки, отходящие от кинетохо­ ров (центромер) каждой хромосомы к полюсу веретена, названы кинетохорными микротрубочками (нитями). Входящие в сос­тав центросфер и лежащие вне веретена деления микротрубочки, ориентированные от центриолей к плазмолемме названы астральными микротрубочками, или микротрубочками сияния (рис. 33). Все микротрубочки веретена находятся в динамическом равновесии между сборкой и разборкой. При этом около 10⁸ молекул тубулина организованы в микротрубочки. Центромеры (кинетохоры) сами способны индуцировать сборку микротрубочек. Следовательно, центриоли и хромосомные центромеры являются в животной клетке центрами организации микротрубочек веретена деления. В индукции роста микротрубочек в зоне полюса деления принимает участие только одна (материнская) центриоль.

Метафаза занимает около трети времени всего митоза. В течение этой фазы заканчивается образование веретена деления и достигается максимальный уровень конденсации хромосом. Последние выстраиваются в области экватора митотического веретена (рис. 31, 34), формируя так называемую «метафазную (экваториальную) пластинку» (вид сбоку) или «материнскую звезду» (вид со стороны полюса клетки). Хромосомы удерживаются в экваториальной плоскости благодаря сбалансированному натяжению центромерных (кинетохорных) микротрубочек. К концу метафазы завершается обособление сестринских хроматид: их плечи лежат параллельно друг другу, а между ними видна разделяющая их щель. Последним местом контакта между хроматидами остаётся центромера.

Анафаза является самой короткой фазой, занимающей лишь несколько процентов времени митоза. Она начинается утратой связи между сестринскими хроматидами в области центромер и движением хро-
матид (дочерних хромосом) к противоположным полюсам клетки
(рис. 31, 34). Скорость перемещения хроматид вдоль трубочек веретена составляет 0,2-0,5 мкм/мин. Инициирует начало анафазы резкое повышение концентрации ионов Са²⁺ в гиалоплазме, выделяемых скопившимися у полюсов веретена мембранными пузырьками.

Движение хромосом складывается из двух процессов: расхождения их по направлению к полюсам и дополнительного расхождения самих полюсов. Предположения о сокращении (саморазборке) микротрубочек как о механизме расхождения хромосом в митозе не подтвердились. Поэтому многие исследователи поддерживают гипотезу «скользящих нитей», согласно которой соседние микротрубочки, взаимодействуя друг с другом (например, хромосомные и полюсные) и с сократительными белками (миозин, динеин), тянут хромосомы к полюсам.

Анафаза завершается скоплением на полюсах клетки по одному, идентичному друг другу, набору хромосом, формирующему так называемую «дочернюю звезду». В конце анафазы в животной клетке начинает образовываться клеточная перетяжка, углубляющаяся в следующей фазе и приводящая к цитотомии (цитокинезу). В её образовании участвуют актиновые миофиламенты, концентрирующиеся по окружности клетки в виде «сократимого кольца».

В телофазе - конечной стадии митоза - вокруг каждой полюсной группы хромосом (дочерние звёзды) образуется ядерная оболочка: фрагменты кариолеммы (мембранные пузырьки) связываются с поверхностью отдельных хромосом, частично окружают каждую из них и только после этого сливаются, образуя полную ядерную оболочку (рис. 31, 34). После восстановления ядерной оболочки возобновляется синтез РНК, из соответствующих участков (ядрышковых организаторов) хромосом оформляется ядрышко и деконденсируется хроматин, переходя в типичное для интерфазы дисперсное состояние.

Ядра клеток постепенно увеличиваются, а хромосомы прогрессивно деспирализуются и исчезают. Одновременно углубляется клеточная перетяжка, а соединяющий их цитоплазматический мостик с пучком микротрубочек внутри сужается (рис. 31). Последующая перешнуровка цитоплазмы завершает разделение цитоплазмы (цитокинез). Равномерному разделению органелл между дочерними клетками способствует их большое количество в клетке (митохондрии) либо распад во время митоза на мелкие фрагменты и мембранные пузырьки.

При повреждении веретена деления может происходить атипический митоз, ведущий к неравномерному распределению генетического материала между клетками (анэуплоидия). Отдельные атипические митозы, при которых цитотомия отсутствует, завершаются образованием гигантских клеток. Атипичные митозы свойственны обычно клеткам злокачественных опухолей и облучённых тканей.

Существует вариант митотического деления, при котором ядерная оболочка не разрушается и веретено деления не формируется. Удвоившийся набор хромосом остаётся в одном ядре. Такое деление клетки названо эндомитозом. Повторные эндомитозы ведут к полиплоидии - значительному увеличению числа хромосом в ядре. Полиплоидия может быть результатом обычных незавершённых митозов. Полиплоидные клетки отличаются повышенной функциональной активностью.

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: