Методы количественной гистологии (морфометрия)

В современной гистологии значительный дополнительный объем ин­формации о гистологическом объекте можно получить при помощи коли­чественных методов. Наиболее простым количественным гистологическим исследованием является подсчет гистологических структур в поле зрения микроскопа или на единицу площади среза. К морфометрическим методам относится также определение размеров гистологических объектов с помо­щью окуляр-микрометра — специальной микролинейки, вставленной в окуляр микроскопа. С морфометрической целью используются и морфо-метрические сетки. На этих сетках имеются точки (узлы). Так, например, наиболее часто используемая морфометрическая сетка Г.Г. Антандилова представляет собой прямоугольник, разделенный на два квадрата. Один из квадратов разделен на 4 более мелких квадрата. В каждом из этих малых квадратов имеется по 25 точек (всего 100 точек). Неразделенный большой квадрат содержит 25 точек. При помощи морфометрической сетки можно определить объемные доли различных структур в гистологическом объекте. Для этого случайным образом накладывают сетку определенное число раз на срез ткани или органа в гистопрепарате и подсчитывают количество точек, выпадающих на различные структуры. Предположим, в препарате соедини­тельной ткани 10 точек выпало на клетки, а на межклеточное вещество при­шлось 90 точек. Следовательно, объемная доля межклеточного вещества 90%, а клеток — 10%. Все эти виды морфометрии называются ручной морфометрией.

В настоящее время существуют достаточно сложные приборы, которые позволяют автоматически производит!) количественные гистологические и гистохимические исследования. Это так называемые автоматизированные системы анализа изображений (АСАИз). В их состав входят: сканирующий световой или электронный микроскоп; видеокамера, которая осуществляет просмотр объекта по двум координатам, а затем следует преобразование его в цифровую форму; ЭВМ, которая обрабатывает полученную цифро­вую информацию и представляет данные о характеристиках исследуемого объекта. С помощью светового дисплея исследователь имеет возможность выделить только интересующие его структуры и получить о них цифро­вую информацию в виде гистограмм и т.д.

ЦИТОСПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

Это метод изучения химического состава клетки. Он основан на изби­рательном поглощении теми или иными веществами лучей с определен­ной длиной волны. По интенсивности поглощения (она зависит от кон­центрации вещества в клетке) определяют содержание этого вещества.

ЦИТОСПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЯ - это метод количественного изучения веществ в клетке по спектрам их флуоресценции.

ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

Гистологическая техника — это техника приготовления гистологического препарата. Гистологическим препаратом может быть срез органа, ткани, мазок, отпечаток, пленочный препарат, культура тканей. Во всех случаях гистологический препарат должен отвечать таким требованиям:

1. Быть прозрачным, т.е. пропускать поток света. Для этого изготав­ливают достаточно тонкие срезы органов, тканей, клеток.

2. Быть контрастным, что достигается окрашиванием препарата.

3. Быть постоянным, т.е. сохраняться длительное время и служить в ка­честве своеобразного документа.

Все эти требования к гистологическому препарату и выполняются в ходе гистологической техники.

Гистологическая техника включает в себя несколько этапов: 1. Взятие материала:

— во время операции;

— от трупов;

— от экспериментальных животных;

— путем пункционной биопсии;

— взятие крови, красного костного мозга путем пункции;

— приготовление отпечатков (с полости рта, влагалища и др.). 2. Фиксация материала.

Фиксация полученного гистологического материала — это воздействие на него химическими веществами, а также физическими факторами, что препятствует дальнейшему разрушению тканей объекта, сохраняет его структуру. Физические фиксирующие факторы — замораживание (твердой углекислотой, в жидком азоте, кислороде и т.д.), воздействие высокой тем­пературы, рентгеновское облучение. Все эти факторы вызывают гибель бактерий и инактивируют собственные ферменты тканей, способствуя со­хранению гистологического материала. Химические фиксаторы также вы­зывают гибель микробов и собственных ферментов тканей, стабилизируют структуру объекта. Различают простые и сложные химические фиксаторы. Простые фиксаторы состоят из одного химического вещества (например, формалин, спирт, уксусная кислота и др.). Эти фиксаторы, однако, приво­дят к определенным нарушениям структуры гистологического материала. Так, формалин вызывает сморщивание его, уменьшение в размерах. Уксус­ная кислота, наоборот, вызывает набухание. Поэтому чаще применяют сложные фиксаторы, в которых отрицательное действие простых фиксато­ров нивелируется. Например, фиксатор ФСУ состоит из 4 частей форма­лина, 1 части спирта и 0,3 частей уксусной кислоты. Этот фиксатор вызы­вает весьма незначительные изменения структуры объекта. Известно мно­жество и других сложных фиксаторов.

Промывка.

Для вымывания фиксатора из тканей используют воду или другие ве­щества (спирт).

Обезвоживание.

Из объекта удаляют воду путем помещения его в спирты возрастаю­щей концентрации, а затем в хлороформ.

Уплотнение материала.

Проводится для того, чтобы из объекта можно было приготовить тон­кие срезы. Выполняется путем заливки в парафин, целлоидин или целлоидинпарафин. Можно уплотнить материал и путем замораживания в жид­ком азоте, что используется в гистохимии ферментов. При этом сохраняют­ся интактными все ферменты.

6. Изготовление срезов.

Этот этап выполняется при помощи приборов МИКРОТОМОВ (рис. 2.8). В них используются очень острые ножи, которые закрепляются не­подвижно. Объект, залитый в парафин, движется вперед в течение каждо­го цикла (оборота) на определенное расстояние (3—10 мкм), и с его повер­хности срезаются срезы такой же толщины (ротационный микротом). В микротомах других конструкций (санные микротомы) неподвижно закреп­ляется объект, а нож движется свободно вперед-назад в горизонтальной плоскости и после каждого цикла движений опускается на заданную тол­щину, производя срезы.

Удаление из срезов парафина.

Срезы помещаются на предметное стекло, подсушиваются и помеща­ются в растворитель парафина — ксилол, толуол, бензол или в другие ве­щества.

Окрашивание срезов.

При помощи окрашивания достигается контрастность препаратов. Для этого используют красители. В зависимости от источника получения они подразделяются на красители животного, растительного происхождения, синтетические. Кроме того, все красители делятся на кислые (обра­зованы кислотами), основные (образованы основаниями) и нейтральные.

Примером кислого красителя может служить эозин, являющийся синтети­ческим красителем. Пример основного красителя — гематоксилин. Он по­лучается из коры некоторых пород деревьев (кампешевое дерево).

 

Красители делятся также на цитоплазматические (окрашивают цитоп­лазму клетки, например, эозин) и ядерные (окрашивают ядро, например, гематоксилин, азур и др.).

ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ТКАНЕЙ. Под тинкториальными свойствами понимают способность тканей и клеток окрашиваться красителя­ми. Для обозначения типкториальных свойств используют такие термины:

1. ОКСИФИЛИЯ — это способность клеток и тканей окрашиваться кислыми красителями. Сами структуры при этом имеют основные свой­ства. Например, эритроциты обладают оксифилией за счет содержания в них основного белка гемоглобина.

2. ЭОЗИНОФИЛИЯ (вариант оксифилии) — способность структур окрашиваться кислым красителем эозином. Эозинофилией обладает ци­топлазма многих клеток.

3. АЦИДОФИЛИЯ — то же, что и оксифилия.

4. БАЗОФИЛИЯ — способность структур окрашиваться основными красителями. При этом сами структуры должны иметь кислую реакцию. Например, нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) обладают базофилией, т.к. по химическим законам могут связывать красители-основания. Благо­даря этому ядро любой клетки в той или иной степени базофильно. Базо­филией обладает также цитоплазма белоксинтезирующих клеток из-за со­держащейся в многочисленных рибосомах РНК.

5. ПОЛИХРОМАТОФИЛИЯ — способность структур клетки окраши­ваться и кислыми, и основными красителями. Таким качеством обладают, например, гранулы нейтрофильных лейкоцитов. Чаще, однако, в качестве синонима используют термин НЕЙТРОФИЛИЯ.

6. МЕТАХРОМАЗИЯ — способность гистологических структур при связывании красителя изменять его цвет. При этом сами структуры окра­шиваются в цвет, который отличается от цвета красителя в растворе. Чаще всего метахромазией обладают углеводные соединения, и появление мета-хромазии говорит о присутствии в клетке или ткани сложных углеводов.

7. АРГЕНТОФИЛИЯ — способность структур окрашиваться солями серебра.

8. ХРОМОФИЛИЯ — способность структур окрашиваться солями хрома.

9. Заключение, или консервация срезов.

На срез наносят каплю синтетической среды или канадского бальзама, а затем покрывают покровным стеклом. После высыхания бальзама препарат прозрачен, может быть подвергнут изучению под микроскопом, спосо­бен долго храниться и может использоваться как своеобразный документ.

ОБРАБОТКА ОБЪЕКТОВ ДЛЯ ТРАНСМИССИОННОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Обработка гистологических объектов для трансмиссионной электрон­ной микроскопии в принципе состоит из тех же этапов, что и описанная выше гистологическая техника: взятия материала, его фиксации, заливки, изготовления срезов и их окрашивания, или контрастирования. Эти этапы имеют свои особенности. Взятый материал не должен превышать размеры 2 мм (обычно берут кусочек органа кубической формы с длиной ребра 1 мм). Фиксируют полученный материал в некоторых альдегидах (глутаральде-гид) с дополнительной фиксацией (постфиксация) в растворе четырехоки-си осмия. При постфиксации происходит одновременное окрашивание структур.

Заливка материала производится в синтетические (эпоксидные) смо­лы: аралдит, эпон и др. Изготовление ультратонких срезов толщиной 30—50 им осуществляется на приборе ультратоме при помощи специаль­ных стеклянных или алмазных ножей. При этом вначале на ультратоме готовят полутонкие срезы, на которых (после их окраски) в световом мик­роскопе находят необходимые для изучения в электронном микроскопе участки. Далее производят "заточку" объекта — удаляют лишние его учас­тки, оставляя необходимые. Затем готовят окончательные (ультратонкие) срезы. Окрашивание (оно называется контрастированием) осуществляют при помощи солей тяжелых металлов (урана, свинца, осмия и др.). Эти соли в разной степени связываются со структурами объекта, что обеспечи­вает различную электронную плотность (контрастность) последних. Пос­ле окрашивания ультратонкие срезы помещают на металлическую сетку и затем изучают в электронном микроскопе.

" Для изучения гистологического объекта в сканирующем электронном микроскопе его вначале подвергают фиксации, затем высушивают. Далее на поверхность объекта напыляют металлы, такие, например, как золото, с тем, чтобы они отражали пучок электронов.

 

 

Глава 3

ЦИТОЛОГИЯ.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: