 |
3.8. Контроль контаминации клеточных культур.
|
|
|
|
3. 8. Контроль контаминации клеточных культур.
Клеточные культуры могут быть загрязнены (контаминированы) бактериями, дрожжами, плесневыми грибами, простейшими, микоплазмами, вирусами, а также самими клетками. По частоте на первом месте стоит контаминация культур бактериями или плесневыми грибами. Загрязнения такого рода практически приводят к потере культуры. Поэтому основное внимание обращают на недопущение инфицирования культур и выявление микробной флоры.
С этой целью проводят контроль стерильности клеточных культур на всех этапах ее производства и хранения.
Как утверждает Л. П. Дьяков и соавт. (2009), это необходимо делать в следующих случаях:
- при изготовлении первичных культур — исходные образцы тканей, а также свежеприготовленная клеточная взвесь;
- перевиваемые линии клеток матричных культур через 5…10 пассажей, но не реже одного раза в 6 мес, а производственные культуры — во время рассадки каждой партии;
- при крупномасштабном суспензионном культивировании клеток — в каждом пассаже;
- при закладке на хранение в атмосфере жидкого азота и после — при восстановлении клеточных расплодов;
- при получении клеточных культур из других лабораторий, учреждений;
- при возникновении признаков контаминации (изменение в культуральной среде — помутнение, изменение цвета, рН, морфологии клеток, их дегенерация, массовая гибель и др. ).
Контроль на наличие бактериальной микрофлоры проводят по общепринятым методикам. Весьма сложно определить контаминацию клеточных культур микоплазмами, требующих весьма сложных сред для выращивания.
Однако наиболее трудно выявить контаминацию клеточных культур латентными и хроническими инфицирующими клетки вирусами. Для этих целей используют:
|
|
|
- контроль культур на наличие морфологических изменений клеток (ЦПД, трансформация и др. );
- обнаружение анигена-контаминанта иммунными сыворотками (классические серологические реакции — нейтрализации, связывания комплемента, диффузионной преципитации, а также — иммунофлюоресцентный, иммуноферментный, радиоиммунный методы и др. )
- сокультивирование исследуемых клеток с чувствительными;
- пассирование материалов на чувствительных клетках;
- реакцию гемадсорбции и гемагглютинации с эритроцитами разных видов животных, птиц, 0 группы крови человека;
- обнаружение телец-включений под световым и люминисцентным микроскопами;
- электронная микроскопия (малопригоден при малой инфицированности материала)
- феномены, отмечаемые при одновременном нахождении двух вирусов в культуре (один из них является маркером с известными свойствами, вносится в культуру экспериментатором): экзольтация — усиление активности одного вируса при взаимодействии с другим; интерференция — подавление активности одного вируса при взаимодействии с другим; образование интерферона (подавление активности одного вируса интерфероном, образовавшимся под воздействием другого вируса-интерфероногена). Данный прием основанный на взаимодействии вирусов применяют при проведении научных исследований и малопригоден в практике;
- образование обратнотранскриптазной активности и реакция гибридизации между нуклеиновыми кислотами клетки и вируса. Пригодны для выявления онкогенных вирусов и выполнимы лишь в условиях специализированной лаборатории;
- метод равновесного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы концентрированной культуральной жидкости, инкубированной в присутствии радиоактивных предшественников синтеза нуклеиновых кислот. Сложность выполнения данного метода ограничивает возможность широкого применения в практике;
|
|
|
- полимеразно-цепная реакция. В настоящее время выполнима в научных учреждениях, в ближайшей практике — высокая вероятность практического использования.
Выбор метода контроля стерильности контаминации определяется видом агента-контаминанта, доступностью метода и рядом других условий.
Деконтаминация представляет трудность, так как методы воздействия на вирусы, бактерии, микоплазмы и другие контаминанты в той или иной степени токсичны для клеток и могут привести к нежелательной селекции клеточных популяций. Наиболее широко для очистки клеточных культур применяют антибиотики, воздействующие на микрофлору. В тоже время освобождение клеточных культур от вирусов процесс весьма трудоемкий доступен в хорошо организованной лаборатории.
Вопросы для самоконтроля
1. Понятие клеточная культура. Виды, методы получения.
2. Для чего используют культуры клеток в вирусологии?
3. Достоинства и недостатки клеточных культур.
4. Солевые растворы.
5. Питательные среды.
6. Диспергирующие растворы.
7. Методы культивирования клеточных культур.
8. Получение первичнотрипсинизированной культуры.
9. Этапы получения перевиваемой клеточной культуры.
10. Заражение клеточной культуры вируссодержащим материалом.
11. Индикация и идентификация вирусов в клеточных культурах.
12. Хранение клеточных культур.
13. Оборудование для работы с клеточными культурами.
14. Контроль контаминации клеточных культур.
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Адамс Р. Методы культур клеток для биохимиков. — М. : Мир, 1983. — 263 с.
2. Белоусова Р. В. Ветеринарная вирусология: учебник для вузов / Р. В. Белоусова, Э. А. Преображенская, И. В. Третьякова. — М: КолосС, 2007. — 424 с.
3. Белоусова Р. В. Практикум по ветеринарной вирусологии: учеб. пособие для вузов / Р. В. Белоусова, Н. И. Троценко, Э. А. Преображенская. — 3-е изд., перераб. и доп. — М: КолосС, 2006. — 248 с.
4. Голубев Д. Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии / Д. Б. Голубев, А. А. Соминина, М. Н. Медведева. — Л. : Медицина, 1976 —224 с.
5. Госманов Р. Г. Ветеринарная вирусология: учебник для вузов / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев. — 2-е изд., доп. и перераб. — М: КолосС, 2006. — 304 с.
|
|
|
6. Дьяконов Л. И. Животная клетка в культуре (методы и применение в биотехнологии) / под. общ. ред. Дьяконова Л. И. — М. : Издательство «Спутник+», 2009. — 656 с.
7. Сергеев В. А. Ветеринарная вирусология: учебное пособие / В. А. Сергеев, Б. Г. Орлянкин., А. А. Гусев, О. И. Сухарев. — Москва Владимир: ОАО " Серпуховская бумажная фабрика", 2001.
8. Сюрин В. Н. Ветеринарная вирусология: учебник для вузов / В. Н. Сюрин, P. В. Белоусова, Н. В. Фомина. — М: Колос, 1984. — 376 с.
9. Сюрин В. Н. Ветеринарная вирусология: Учебник / В. Н. Сюрин, P. В. Белоусова, Н. В. Фомина. — 2-е изд., перераб. и доп. — М: Агропромиздат, 1991. — 431 с.
10. Сюрин В. Н. Вирусные болезни животных / Сюрин В. Н. [и др. ]. — М: ВНИТИБП, 1998. — 928 с.
11. Теоретические и практические проблемы гнотобиологии / Всесоюз. акад. с. -х. наук им. В. И. Ленина, Академия медицинских наук СССР. — М. : Агропромиздат, 1986. — 239 с.
12. Троценко Н. И. Практикум по ветеринарной вирусологии: учеб. пособие для вузов / Н. И. Троценко, Р. В. Белоусова, Э. А. Преображенская. — 2-е изд., перераб. и доп. — М: Колос, 1999; , 2000. — 272 с.
Приложение 1
|
|
|
