 |
Нанопоровое секвенирование.
|
|
|
|
Геномика как наука. Цели, задачи геномики. История развития. Роль геномики в развитии медицины, фундаментальной биологии. Персональная медицина.
Геномика – наука, изучающая организацию, функции и эволюцию геномов. Термин "геномика" производный от генома -- совокупности всех генов организма;
Структурная геномика: генетическое, физическое картирование, секвенирование геномов.
Функциональная геномика: функции генов и некодирующих последовательностей в геномах.
Сравнительная геномика: сравнение геномов различных организмов. Эволюционная задача.
Три основных направления:
· Структурная геномика: генетическое, физическое картирование, секвенирование геномов.
· Функциональная геномика: функции генов и некодирующих последовательностей в геномах.
· Сравнительная геномика: сравнение геномов различных организмов. Эволюционная задача.
Основная цель: Понять, как функционирует живой организм.
Задачи геномики. Установление полной генетической характеристики всей клетки -- количества содержащихся в ней генов и их последовательности, количества нуклеотидов в каждом гене и их последовательности, определение функций каждого гена по отношению к метаболизму организма или, более обще, применительно к его жизнедеятельности.
Геномика позволяет выразить сущность организма -- его потенциальные возможности, видовые (и даже индивидуальные) отличия от других организмов, предвидеть реакцию на внешние воздействия, зная последовательность нуклеотидов в каждом из генов и число генов.
История.
• 1975 – Ф. Сенгер и независимо А. Максам и У. Гилберт разработали методы секвенирования ДНК.
• 1977 – Секвенирован бактериофаг фX-174: первый полный геном.
|
|
|
• 1981 – Секвенирована митохондриальная ДНК человека
• 1999 – Опубликована первая полная последовательность одной из хромосом человека.
• 2000 – Совместное заявление о полной расшифровке генома человека
Роль в медицине.
• Выявление генетических и внешних факторов всех распространенных болезней
• Разработка подходов к ранней диагностике и профилактике болезней
• Разработка подходов к генотерапии наследственных болезней
• Разработка лекарственных препаратов «направленного действия» и генотип-специфических препаратов (Фармакогеномика)
• Разработка «молекулярной» классификации болезней человека.
Роль в биологии.
• Выявление структуры вариабельности генома - карта гаплотипов
• Секвенирование геномов многих видов
• Развитие технологий секвенировния, генотипирования, анализа экспрессии, протеомики
• Вывление всех функциональных элементов в геноме человека (генов, регуляторных участков)
• Выявление всех белков в клетке и их взаимодействий (Протеом)
• Разработка моделей клетки и взаимодействия клеточных компонентов (Целлом)
• Выявление всех метаболитов и моделирование метаболических процессов (Метаболом)
• Развитие математических и компьютерных методов анализа генома и реализации генетической информации (Биоинформатика).
Песональная медицина.
• Диагностика, предсказание и предотвращение
• Разработка и применение лекарственных препаратов (фармакогеномика)
Примеры индивидуальных ДНК-тестов:
• Тесты на носительство
• Тесты, оценивающие риски заболевания
• Тесты, оценивающие ответ организма на те или иные лекарственные препараты
Пиросеквенирование. Принцип метода.
Пиросеквенирование это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов вмолекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путем синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов.
|
|
|
1987 год — Пол Нирен разработал метод анализа ДНК-полимеразной активности, основанный на определении пирофосфата; двумя годами ранее Пол Нирен разработал метод определения пирофосфата;
Принцип метода основан на (+/-)-секвенировании. При последовательном добавлении к ДНК-полимеразному комплексу дезоксинуклеозидтрифосфатов их включение в синтезируемую нить зависит от нуклеотидной последовательности матрицы. Полимеразный синтез ДНК сопровождается выделением пирофосфата. Этот пирофосфат в присутствии сульфурилазы и аденозинфосфосульфата преобразуется в АТФ и запускает окисление люциферина люциферазой, сопровождающееся биолюминесценцией. Люминесценция регистрируется фотоумножителем или цифровой камерой.
Существенной особенностью более сложной технологии является использование эмульсионной ПЦР для одновременной параллельной подготовки сотен тысяч препаратов ДНК к секвенированию. Такая пробоподготовка состоит из ряда этапов.
Также в технологии используются специальные проточные камеры. Они содержат сотни тысяч микролунок, заполняемых шариками с образцами анализируемой ДНК и микрошариками с иммобилизованными ферментами.
Нанопоровое секвенирование.
Метод основан на измерении тока ионов через единичную нанопору в непроводящей мембране. При прохождении через эту пору нуклеотидов ток падает. Время, на которое изменяется ток ионов, и величина этого падения зависят от того, какой нуклеотид в данный момент находится внутри поры.
Первая работа, описывающая возможность применения нанопор для определения характеристик нуклеиновых кислот, появилась в 1996 году.
Нанопоровые системы представляют собой реакционную камеру, внутри которой находится раствор электролита. Камера разделена на две части липидной мембранной или иной тонкой непроводящей поверхностью, в которую внедрена единичная нанопора. К частям камеры прикладывают напряжение, из-за чего возникает ток ионов через пору.
Когда исследуемые молекулы проходят через пору по направлению поля, они уменьшают сечение, доступное для ионов, и сила тока падает. Анализируя изменение силы тока, можно определить свойства молекулы, проходящей через пору.
|
|
|
В случае нуклеиновых кислот, диаметр используемых нанопор составляет несколько нанометров, из-за чего ДНК и РНК способны проходить сквозь пору только в одноцепочечной форме, но не в двухцепочечной. При прохождении молекулы нуклеиновой кислоты через пору отдельные нуклеотиды задерживаются в определенных сайтах внутри поры, в результате чего происходит измеримое падение силы тока.
По сравнению с уже существующими методами секвенирования применение нанопор обладает следующими преимуществами:
· Дешевизна и простота использования, достигается отсутствием необходимости приготовления образца и использования реактивов;
· Высокая чувствительность, вплоть до секвенирования без амплификации ДНК из крови или слюны;
· Высокая длина прочтений, вплоть до десятков тысяч оснований.
Это не обязательно- (В зависимости от того, сохраняют ли секвенируемые молекулы нуклеиновых кислот свою химическую целостность, выделяют следующие методы: Секвенирование целых цепочек, Транспорт под действием напряжения, Транспорт под действием напряжения с расплетанием дуплексов, Транспорт с использованием ферментов, Экзонуклеазное секвенирование)
|
|
|
