 |
Раздел I. Пигменты фотосинтетического аппарата
|
|
|
|
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
Биологический факультет
Кафедра биохимии и физиологии растений
Ю.В. Синицына
Л.Н. Олюнина
Е.О. Половинкина
Фотосинтез и дыхание растений
Учебно-методическое пособие
Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов ННГУ, обучающихся по направлениям подготовки 020200 «Биология» и 020800 «Экология и природопользование» и специальностям 020201 «Биология», 020801 «Экология» и 020207 «Биофизика»
Нижний Новгород
УДК 581.1
ББК Е573
В-57
В-57 Синицына Ю.В., Олюнина Л.Н., Половинкина Е.О. ФОТОСИНТЕЗ И ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ: Учебно-методическое пособие. – Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2008. – 28с.
Рецензент: доц., канд. биол. наук О.В. Орлова
Учебно-методическое пособие включает описание лабораторных работ по разделам «Фотосинтез» и «Дыхание» курса «Физиология растений». Работы, предлагаемые в разделе I характеризуют основные химические и оптические свойства пигментов и их разделение с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках силуфола, что является иллюстрацией раздела соответствующего теоретического курса. В работах, представленных в разделе II, описаны методы определения интенсивности фотосинтеза. Работы, приведенные в разделе III, характеризуют работу ферментов дыхания, а также знакомят с методами анализа интенсивности дыхания. Приводятся методические указания по выполнению работ, перечислены необходимые материалы и оборудование.
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов-биологов университетов, а также педагогических и сельскохозяйственных ВУЗов, может быть использовано учителями школ при проведении лабораторных занятий, демонстрации опытов на уроках.
|
|
|
УДК 581.1
ББК Е573
© Нижегородский государственный
Университет им. Н.И. Лобачевского, 2008
СОДЕРЖАНИЕ
РАЗДЕЛ I. ПИГМЕНТЫ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА…………..4
Работа 1. Получение спиртовой вытяжки пигментов и
изучение их химических и оптических свойств…………………….…5
Работа 2. Разделение смеси пигментов с помощью
бумажной хроматографии……………………………………………….8
Работа 3. Сравнение качественного состава пигментов
высших растений разных систематических групп…………………..…9
Работа 4. Определение содержания основных пигментов
фотосинтетического аппарата в листьях высших растений…………..10
РАЗДЕЛ II. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ
ФОТОСИНТЕЗА……………………………………………………….13
Работа 5. Определение интенсивности фотосинтеза
высшего водного растения по выделению кислорода………………...13
Работа 6. Обнаружение фотосинтеза методом
крахмальной пробы (по Саксу)…………………………………………14
Работа 7. Определение интенсивности фотосинтеза по поглощению
углекислого газа (по Л.А. Иванову и Л.Н. Коссович)…………….…..15
РАЗДЕЛ III. ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ…………………………………………….17
Работа 8. Определение интенсивности дыхания по количеству выделенного
диоксида углерода (по Бойсен-Йенсену)………………………….......17
Работа 9. Обнаружение активности ферментов дыхания………………………..20
Работа 10. Определение интенсивности дыхания растений по поглощению
кислорода манометрическим методом Варбурга……………….........23
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………….27
РАЗДЕЛ I. ПИГМЕНТЫ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
|
|
|
Пигменты растений – это различные вещества, имеющие окраску и способные к избирательному поглощению части солнечного спектра в области 300–800 нм. К числу пигментов относят разнообразные соединения, участвующие не только в фотохимических, но и энзиматических реакциях, например, флавины, разнообразные хиноны – коферменты биокаталитических систем, близкие к ним цитохромы.
Пигменты фотохимических реакций делят на две группы:
1. Тетрапирролы:
а) хлорофиллы – Mg-порфирины, в основе химического строения которых лежит порфириновое кольцо;
б) фикобилины – тетрапирролы с незамкнутой системой;
2. Полиизопрены – каротиноиды.
Особенно важное значение в реакциях фотосинтеза принадлежит хлорофиллам. Сегодня известно более 10 пигментов, входящих в группу хлорофиллов и различающихся между собой некоторыми структурными особенностями.
Основные хлорофиллы «а» и «b» характерны для высших растений и водорослей, «с» – для бурых и диатомовый водорослей, «а» и «d» – для красных водорослей, бактериохлорофилл – для фотосинтетических бактерий, осуществляющих фоторедукцию.
В основе структуры хлорофилла лежит порфирин – полярная часть молекулы, и фитольный «хвост» (остаток одноатомного непредельного спирта фитола) – гидрофобная часть, заякоривающая молекулу хлорофилла в липидном бислое мембраны тилакоида.
В порфирине выделяют 3 структурных элемента:
1. сопряженная система двойных и одинарных (конъюгированных) связей, обеспечивающая поглощение света;
2. Mg, определяющий физические и химические свойства хлорофилла, способный изменять спектральные и конформационные характеристики молекулы, обеспечивающий связь хлорофилла с белком и пигмент-пигментные взаимодействия;
3. циклопентановое кольцо, содержащее кетогруппу – эта полярная группировка обеспечивает связь хлорофилла с молекулой воды и гидрофильность всей порфириновой структуры.
Фитол (C20H39OH) не участвует в поглощении энергии света, но ориентирует молекулу хлорофилла в структуре хлоропласта.
Хлорофиллы выполняют следующие функции:
а) поглощение энергии света в красной и сине-фиолетовой частях спектра;
б) запасание энергии;
в) преобразование ее в реакционных центрах.
|
|
|
Остальные группы пигментов являются дополнительными (вспомогательными).
Фикобилины – пигменты водорослей, главными из которых являются фикоэритрин и фикоцианин. Они способны активно поглощать энергию света в зеленой части спектра, т.е. области между двумя максимумами поглощения хлорофиллов.
Фикобилины являются хромофорными группами фикобилипротеинов – глобулиновых белков, с которыми, в отличие от хлорофиллов, они связаны прочными ковалентными связями и не способны преобразовывать энергию.
Водорастворимые фикобилипротеины локализованы в клетках водорослей в специальных гранулах – фикобилисомах.
Каротиноиды – жирорастворимые пигменты желтого, оранжевого и красного цвета – присутствуют в хлоропластах всех растений.
Все каротиноиды – полиеновые соединения, состоящие из восьми остатков изопрена, которые образуют цепь конъюгированных связей. Каротиноиды могут быть нециклическими (алифатическими), моно- и бициклическими. Циклы на концах молекул каротиноидов являются производными ионона.
С точки зрения фотосинтеза интересны:
каротины – неполярные соединения;
ксантофиллы – кислородсодержащие производные каротинов.
Каротины локализованы в липидной фракции мембраны, ксантофиллы имеют в своем составе кислород и более полярны. Как и хлорофиллы, каротиноиды нековалентно связаны с белками и липидами мембран.
Каротиноиды выполняют следующие функции:
1. дополнительное поглощение энергии света;
2. защита хлорофилла от фотоокисления;
3. ксантофиллы участвуют в формировании молекулярного кислорода.
Работа 1. Получение спиртовой вытяжки пигментов и изучение их химических и оптических свойств.
Объектом исследования служат листья и зеленые проростки растений различных систематических групп.
Получают спиртовую вытяжку пигментов и исследуют их основные химические свойства.
Ход определения.
Мелко нарезанные листья или проростки (3 – 4г) растирают с СаСО3 и 15 – 20 мл этанола. Вытяжку фильтруют в сухую колбочку через бумажный фильтр. Вытяжка представляет собой смесь пигментов – хлорофиллов “a” и “b”, каротинов, ксантофиллов. Полученную вытяжку используют при исследовании химических свойств пигментов.
|
|
|
А. Разделение пигментов по Краусу.
Метод основан на различной растворимости пигментов в спирте и гептане (бензине). Эти растворители при сливании не смешиваются и образуют две фазы: верхнюю – гептановую (бензиновую), нижнюю – спиртовую, поэтому и происходит разделение компонентов смеси.
Ход определения.
В пробирку наливают 2 – 3 мл спиртовой вытяжки и добавляют 3 – 4 мл гептана (бензина). Содержимое пробирки встряхивают и дают отстояться. При этом происходит разделение слоев:
верхний – зеленый гептановый (бензиновый) слой содержит хлорофиллы
“a” и “b” и каротин;
нижний – желтый спиртовой содержит ксантофиллы.
Б. Омыление хлорофилла щелочью.
Молекула хлорофилла представляет собой эфир двухосновной хлорофиллиновой кислоты с двумя спиртами – фитолом и метанолом. При реакции со щелочью хлорофилл омыляется, давая соответствующие соли и спирты:
COOCH3 COONa
С32H30ON4Mg + 2NaOH C32H30ON4Mg +
COOC20H39 COONa
+ CH3OH + C20H39OH
Образующаяся при этом соль хлорофиллиновой кислоты сохраняет зеленую окраску и оптические свойства хлорофилла.
Ход определения.
В пробирку со спиртовой вытяжкой пигментов приливают 2 – 3 капли 20% раствора КОН или NаОН. Пробирку встряхивают и дают отстояться, затем добавляют равный объем гептана (бензина). При этом происходит разделение слоев:
верхний – желтый гептановый (бензиновый) из-за присутствия каротина;
нижний – зеленый спиртовой, т.к. в нем растворяются продукты омыления хлорофиллов – их щелочные соли. Здесь же находится и ксантофилл.
В. Получение феофитина и обратное замещение водорода на атом металла.
Атом Mg в молекуле хлорофилла легко замещается двумя атомами водорода при воздействии сильных кислот. Это приводит к образованию феофитина бурого цвета:
COOCH3 COOCH3
C32H30ON4Mg + 2HCl C32H32ON4 +MgCl2
COOC20H39 COOC20H39
Если на феофитин подействовать солями Cu, Zn, Pb, то вместо двух атомов водорода в ядро хлорофилла входит соответствующий металл, и вновь восстанавливается зеленая окраска:
COOCH3 COOCH3
C32H32ON4 + Cu(CH3COO)2 C32H30ON4Cu +
COOC20H39 COOC20H39
+ 2CH3COOH
Ход определения.
В две пробирки берут 2 – 3 мл спиртовой вытяжки пигментов и прибавляют 2 – 3 капли 10% HCl. При взбалтывании зеленая окраска хлорофилла переходит в бурую, характерную для феофитина. Далее одну пробирку с феофитином оставляют для контроля, а во вторую вносят несколько кристаллов уксуснокислой меди, раствор нагревают на водяной бане. После нагревания бурый цвет раствора меняется на зеленый вследствие образования хлорофиллоподобного производного меди.
|
|
|
Реактивы и оборудование.
1. CaCO3 сухой,
2. Этанол,
3. Гептан (бензин),
4. 20% NaOH,
5. 10% HCl,
6. Cu(CH3COO)2 сухой,
7. Ступки,
8. Колбы конические 50 мл,
9. Воронки,
10. Фильтры,
11. Пробирки на 10 мл,
12. Пипетки на 5 и 1 мл,
13. Ланцеты,
14. Водяная баня (кипящая).
Работа 2. Разделение смеси пигментов с помощью бумажной хроматографии.
Хроматографический метод разделения пигментов, впервые предложенный русским ученым М.С. Цветом, заключается в том, что раствор, содержащий смесь пигментов, пропускают через слой адсорбента. Различные пигменты, обладая неодинаковой растворимостью в данном растворителе и разной адсорбируемостью, передвигаются по мере движения растворителя с различной скоростью и располагаются на адсорбенте в разных местах. Чем выше растворимость пигмента в растворителе, тем быстрее он будет передвигаться, и тем дальше от старта будет располагаться зона этого пигмента.
Ход работы.
Измельченные свежие листья помещают в ступку, добавляют немного CaCO3 для нейтрализации органических кислот клеточного сока, а также кварцевого песка или толченого стекла и растирают, постепенно приливая ацетон (на 2 – 3 г листьев примерно 25 мл ацетона). Полученный раствор фильтруют в сухую чистую колбу.
Наливают вытяжку в бюкс и погружают в нее кончик полоски из хроматографической бумаги (3´20 см). Через несколько секунд, когда вытяжка поднимется по бумаге на 1 – 1.5 см, высушивают бумагу на воздухе и снова погружают в раствор пигментов на несколько секунд. Эту операцию повторяют 5–7 раз до тех пор, пока у верхней границы распространения пигментов на бумаге не образуется темно-зеленая полоска. После этого погружают кончик бумажной полоски в ацетон, чтобы все пигменты поднялись на 1 – 1.5 см.
Высушив полоску до полного исчезновения запаха ацетона, ее помещают в вертикальном положении в хроматографическую камеру (цилиндр, на дно которого налита смесь растворителей бензин: бензол в отношении 1:2) и плотно закрывают крышкой.
Через 10 – 15 мин растворитель поднимается по бумаге на 10 – 12 см, при этом пигменты располагаются в виде полос в следующем порядке:
каротины (поднимаются с фронтом (растворителя)
ксантофиллы
хл. а
хл. b
Рис.1. Распределение пигментов на бумаге.
Вклеивают полученную хроматограмму в отчет, подписывают пигменты и делают вывод о причинах разделения пигментов на бумаге.
Реактивы и оборудование.
1. Ацетоновая вытяжка пигментов,
2. Бензин (гептан),
3. Бензол,
4. Хроматографическая бумага,
5. Хроматографическая камера,
6. Пинцет.
Работа 3. Сравнение качественного состава пигментов высших растений разных систематических групп.
Объектами сравнения служат листья высших растений различных систематических групп. Смесь пигментов разделяют при помощи различных видов хроматографии – например, на бумаге или на пластинках силуфола.
Ход работы.
Разделение пигментов производят на пластинках силуфола (UV-254, Чехословакия) размером 3´15 см. Силуфол – это пластинки для тонкослойной хроматографии на алюминиевой фольге. В качестве сорбента используют силикагель, связывающим веществом является крахмал.
На пластинки силуфола с помощью микропипетки наносят спиртовую вытяжку пигментов полоской 1.5 см на расстоянии 2 см от нижнего края пластинки. Полоску подсушивают струей воздуха (вентилятор), а затем помещают в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную смесью растворителей следующего состава:
гептан: ацетон: эфир: гексан
10: 10: 3: 10
На одну пластинку наносят вытяжку пигментов высших растений разных систематических групп. Разгонку пигментов производят в камере с плотно закрытой крышкой и затемненной темной бумагой. Фронт растворителя поднимается вверх до 2 см от верхнего края пластинки. Хроматограмму вынимают и высушивают в токе воздуха.
Полученную хроматограмму вклеивают в отчет с помощью прозрачного скотча, расшифровывают (рис.2) и подписывают.
/\/\/\/\/\/\/\/\ Каротины
/\/\/\/\/\/\/\/\ Феофитин
/\/\/\/\/\/\/\/\ Артероксантин
/\/\/\/\/\/\/\/\ Хл. а
/\/\/\/\/\/\/\/\ Хл. b
/\/\/\/\/\/\/\/\ Лютеин + зеаксантин
/\/\/\/\/\/\/\/\ Виолаксантин
/\/\/\/\/\/\/\/\ Неоксантин
Старт
Рис.2. Распределение пигментов на силуфоле.
Реактивы и оборудование.
1. Спиртовая вытяжка пигментов
2. Растворитель (гептан: ацетон: эфир: гексан – 10: 10: 3: 10)
3. Пластинки силуфола
4. Микропипетки
5. Вентиллятор
6. Хроматографическая камера.
Работа 4. Определение содержания основных пигментов фотосинтетического аппарата в листьях высших растений.
Объектом определения служат листья высших растений разных видов или листья разного возраста. Содержание хлорофиллов “a” и “b” определяют спектрофотометрически, рассчитывают соотношение хл. а / хл.b в исследуемом материале.
Работа проводят в два этапа:
- экстракция пигментов;
- определение их концентрации с помощью спектрофотометра или ФЭКа
(фотоэлектроколориметра).
Пигменты могут быть экстрагированы из свежего или фиксированного материала с помощью смеси полярных (спирт, ацетон) и неполярных (эфир, гексан, бензин) растворителей. Полярные растворители расщепляют связь между пигментом и белком и переводят все пигменты в раствор. Поскольку пигменты быстро выцветают на свету, экстрагировать их лучше в затемненном помещении.
Количественное определение пигментов основано на использовании их оптических свойств. В зависимости от природы растворителя для расчетов используют следующие формулы:
а) в 80%-ном ацетоне:
Ca = 12.7´D663 – 2.58´D644 (мг/л)
Cb = 22.9´D644 – 4.66´ D663 (мг/л)
б) в серном эфире:
Ca = 9.93´D660 – 0.78´D642 (мг/л)
Cb = 17.6´D642 – 2.81´D660 (мг/л), где
Сa, Cb – концентрация хлорофилла а, хлорофилла b, соответственно,
D663, D644, … - оптическая плотность раствора при указанной длине волны
Возможно определение концентрации пигментов по заранее построенным калибровочным кривым.
Ход определения.
Навеску растительного материала (500 мг) растирают в присутствии CaCO3 с 4 – 5 мл 80%-ного ацетона. Полученную вытяжку фильтруют в сухую колбочку. Операцию повторяют несколько раз, пока стекающая жидкость не будет прозрачной. Вытяжку помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем растворителем. Полученная вытяжка содержит сумму зеленых и желтых пигментов.
Концентрацию хлорофилла определяют с помощью ФЭКа. Используя красный светофильтр (650 нм) и кюветы шириной 10 мм, определяют оптическую плотность раствора относительно чистого растворителя (ацетона). Для предотвращения испарения ацетона кюветы лучше закрыть крышечками. Результаты получаются надежными при показаниях ФЭКа от 0.1 до 0.4. Если оптическая плотность выше 0.5, то вытяжку следует разбавить. Если же показания ФЭКа меньше 0.08, работу следует повторить с самого начала, взяв большую навеску.
Измерения повторяют несколько раз, а из полученных отсчетов берут среднее арифметическое, затем определяют концентрацию хлорофилла в вытяжке по калибровочному графику (рис.3).
Содержание хлорофилла в листьях пересчитывают на 1 г сырого веса листьев. Для этого полученное по графику значение умножают на объем вытяжки – находят количество мг хлорофилла в суммарной вытяжке. Эта вытяжка была получена из 500мг сырого веса листьев, следовательно, для расчета на 1 г сырого веса, полученный результат следует умножить на 2.
 |
Рис.3. Оптическая плотность ацетоновой вытяжки хлорофилла.
Реактивы и оборудование.
1. СаСО3 сухой
2. 80% ацетон
3. Колбы 50 мл
4. Мерные колбы на 25 мл
5. Ступки
6. Ножницы
7. ФЭК, спектрофотометр
8. Кюветы шириной 10 мм
9. Бумажные фильтры
|
|
|
