 |
Методы исследования мужских половых клеток
|
|
|
|
Изучение спермальной морфологии. Спе́рма (от греч. σπερμα – семя), семя, эякулят (эйякулят) – жидкость (мутная, вязкая, опалесцирующая, светло-серого цвета), выделяемая при эякуляции (семяизвержении) самцами животных. Состоит из сперматозоидов и семенной жидкости.
Объём спермы, выделяемой при каждой эякуляции, различен у разных видов: у человека в среднем 2 − 4 мл; у быка 4 − 5 мл; у жеребца 60 − 100; у дикого кабана до 250; у барана 1 − 1,5; у кита до 3000 мл.
Рисунок 6 – Формы сперматозоидов человека и животных:
1 – человек; 2 – тритон; 3 – речной рак; 4 – морская свинка; 5 – свинья; 6 – бык; 7 – петух; 8 – ветвистоусый рак, 9 – десятиногий рак; 10 – лошадиная аскарида; 11 – острица
Вещества, содержащиеся в сперме: аскорбиновая кислота, кальций, характерные для каждой группы крови антитела, холестерин, холин, лимонная кислота, фруктоза, дезоксирибонуклеиновая кислота, витамин В12, глутатион, инозит, молочная кислота, спермин, мочевина, гиалуронидаза, гиалуроновая кислота, пировиноградная кислота, пиримидин, спермидин, мочевая кислота, ионы Zn2+, Cl−, Mg2+, NO3−, PO43−, K+, Na+.
Оплодотворяющее действие спермы зависит от количества и качества сперматозоидов. Количество сперматозоидов в сперме животных неодинаково (у барана − около 30 %, у быка около − 14 %, у хряка, жеребца − 7 − 8 %) и может варьироваться у одного и того же животного в зависимости от условий жизни (рис. 6). У большинства беспозвоночных и некоторых позвоночных животных (рыб, земноводных, пресмыкающихся, многих птиц и млекопитающих) наблюдается сезонность выделения спермы. При некоторых патологических состояниях организма сперма может быть лишена сперматозоидов (азооспермия), иметь их в небольшом количестве (олигоспермия), содержать неподвижные (некроспермия) или аномальные сперматозоиды (тератоспермия).
|
|
|
В медицине анализ спермы используют для установления причин бесплодия и для искусственного оплодотворения.
В судебно-медицинской практике анализ спермы, как и других биологических жидкостей, используется для идентификации личности.
В сельскохозяйственном производстве сперма используется при искусственном осеменении животных.
Сперма состоит из форменных элементов – спермиев, секретов придатка семенника и секретов придаточных половых желез. Порция спермы, выделяемая самцом за одну садку, называется эякулятом. Объем эякулята и концентрация в нем спермиев у самцов разных видов различны. В пределах вида это зависят от интенсивности использования производителя (частоты садок), условий кормления и содержания. При серьезных нарушениях в кормлении и эксплуатации производителей объем эякулята может снижаться ниже минимально допустимого – олигосперматизм. При глубоких поражениях половых органов, а также в результате рефлекторной задержки эякуляции (при болевых ощущениях в области конечностей, таза, поясницы) сперма может не выделяться совсем – асперматизм. Это же явление наблюдается при спазматическом сокращении выводных протоков половых органов.
Количество и внешний вид спермы, соотношение жидкой части и спермиев варьируют в зависимости от вида животных и их индивидуальных особенностей. Соотношение отдельных составных частей спермы у различных животных разное. Так, придатки семенников быка выделяют 0,6 мл жидкости с содержанием спермиев 4,9 млрд/мл и общим количеством их около
3 млрд. Спермии с секретом придатков составляют 15 % объема эякулята, секрет пузырьковидных желез – до 40 %, предстательной железы – 5 − 6,1; куперовых и уретральных желез – 35 − 40 %. Сперма содержит 85 − 98 % воды и 2 − 15 % сухого вещества.
|
|
|
Спермии – основная часть спермы, без них невозможно оплодотворение. Спермий состоит из головки, шейки (соединительной части), тела и хвоста (жгутика). Спермий содержат около 25 % сухого вещества и
75 % воды. Из сухого вещества 85 % составляют белки, 13,2 % – липиды и
1,8 % – минеральные вещества. В спермиях имеется также значительное количество фосфора (около 2,7 %), причем в головках содержание его доходит до 4%. В головках спермиев присутствует большое количество белков, связанных с ДНК. В акросоме установлено некоторое наличие мукополисахаридов. Остальные части спермиев (шейка, тело и хвост) состоят из белков, свободных липидов и солей. Спермии содержат ряд ферментов, принимающих участие в окислительных процессах, происходящих внутри их (рис. 4).
Часть спермы, не содержащая спермиев, называется плазмой спермы (семенной плазмой). Ее относительный объем в эякуляте зависит от вида животных (70 % у барана, 30 % у быка, 90 − 92 % у хряка и жеребца). Семенная плазма продукт в основном придаточных желез, является стабилизирующей, разбавляющей, активирующей и питательной средой для спермиев. Она стабилизирует плазменную мембрану спермиев, содержит энзимы, растворяющие акросому, простогландины, инозит, андрогены, антиагглютинины (в секрете простаты), аскорбиновую кислоту, фруктозу, лимонную кислоту. При кастрации уровень двух последних компонентов падает.
Свойства спермиев. Жизнеспособность спермиев вне организма зависит от температуры и состава жидкости, в которой они находятся. Наиболее подвижны спермии при температуре, близкой к температуре тела животных (37 − 39 ° С). Более высокая температура убивает их. При понижении температуры движение спермиев замедляется, а при температуре, близкой к 0 0 С, они переходят в состояние анабиоза. При нарушении осмотического давления в окружающей среде спермии гибнут. В гипотоническим растворах гибель спермиев наступает вследствие набухания их от проникновения внутрь воды, а в гипертонических – наоборот, в результате обезвоживания цитоплазмы. Свежеполученная сперма быка и барана имеет нейтральную (рН 7,0) или слабокислую реакцию (рН 6,7 − 6,9), сперма хряка и жеребца – щелочную (рН 7,2 − 7,6). Небольшое увеличение кислотности в сперме ведет к замедлению движения спермиев, но они остаются живыми. Избыточная кислотность прекращает движение спермиев и убивает их. Чрезмерная щелочность, достигаемая, например, добавлением соды, усиливает движение спермиев, но затем убивает их.
|
|
|
Дыхание − наиболее распространенный процесс у спермиев, при котором окисляются все питательные вещества – белки, жиры и углеводы с образованием энергии Н2О, СО2 и других продуктов. Этот процесс происходит под влиянием целого ряда дыхательных ферментов – цитохромоксидазы, дегидрогеназы, цитохромов и рибофлавина – составной части флавиного фермента.
Гликолиз (фруктолиз). Характеризуется выделением энергии для жизненных процессов, протекающих в спермиях без доступа воздуха. Этот процесс отличается от дыхания тем, что при нем расщепляются только отдельные сахара, такие как фруктоза и глюкоза. Фруктоза при гликолизе распадается до молочной кислоты с освобождением энергии. Распад фруктозы до молочной кислоты с освобождением энергии под влиянием ферментов проходит через следующие звенья: фруктозофосфорная кислота, фруктозодвуфосфорная кислота, фосфотриоза – фосфоглицериновая кислота, фосфопировиноградная кислота, пировиноградная кислота. Эта реакция обратима, так как часть молочной кислоты способна снова переходить в сахара.
Дыхание и гликолиз по своим энергетическим возможностям неравнозначны. Из одного моля фруктозы при дыхании образуется 680 000 кал, а при гликолизе – лишь 33 000 кал, то есть в 20 раз меньше. Дыхание является наиболее экономным с точки зрения распада углеводов и наиболее эффективным процессом, снабжающим спермии энергией.
На основании этого выделены два типа спермы: в первом (бык и баран) энергия образуется за счет процессов дыхания и гликолиза, так как в ней содержится много фруктозы (200 − 300 мг%), во втором (хряк и жеребец) энергия образуется главным образом при дыхании, так как малое содержание в ней фруктозы неспособно обеспечивать гликолиз.
|
|
|
Оценка качества спермы животных. Полученную от производителя сперму подвергают исследованию, чтобы определить ее пригодность для осеменения. Оценка качества спермы является важным звеном в технологическом процессе на станциях и пунктах искусственного осеменения. От качества спермы в значительной степени зависит оплодотворяемость самок. Исследованию подвергают каждый эякулят в отдельности. При взятии спермы у быков-производителей, когда берут подряд два эякулята, следует оценивать качество каждого порознь, а уже затем их можно смешать (если это необходимо). Если один из эякулятов имеет показатели ниже допустимых по инструкции, его нельзя употребить для осеменения.
Санитарная оценка спермы по внешним признакам. Сразу же после взятия эякулята определяют его объем и исследуют цвет, запах и консистенцию (эту оценку иногда называют макроскопической или органолептической). Цвет спермы зависит прежде всего, от вида животного. Нормальная сперма барана белая с желтоватым оттенком, сперма быка чаще всего белая, иногда с желтоватым оттенком, сперма жеребца и хряка серовато-белая (наподобие цвета разбавленного молока). Розовая или красноватая окраска спермы свидетельствует о примеси крови, попавшей в сперму в результате свежей травмы половых органов. Темно-красный цвет сперма приобретает при свежих разрывах мелких капилляров мочеполового канала, буро-красную – при травмах давнего происхождения. Буроватые сгустки в сперме или зеленоватая окраска ее указывает на примесь в сперме гноя. Хлопья в сперме появляются при воспалении пузырьковидных желез. Интенсивно желтый цвет спермы говорит о примеси в ней мочи. Запах спермы обычно слабый специфический. Сперма барана имеет запах жиропота. Наличие неприятного гнилостного запаха указывает на воспалительный процесс в половых органах производителя. Сперма с патологическими включениями и гнилостным запахом, а также с наличием трихомонад или бактерий (если они видны под микроскопом) непригодна для осеменения самок. Консистенция спермы зависит главным образом от насыщенности ее сперматозоидами. Нормальная сперма барана по консистенции похожа на сливки или сметану, сперма быка – на молоко, сперма хряка и жеребца имеет водянистую систему. В сперме жеребца часто бывает примесь железистого секрета пузырьковидных желез, в сперме хряка – студенисто-клейкие зерна луковичных желез. Объем эякулята быка и барана измеряют по делениям на спермоприемнике, при помощи градуированной пипетки или шприца, а также в градуированной смесительной колбе для спермы быка. Эякулят в полиэтиленовом спермоприемнике одноразового пользования взвешивают на весах. Все приспособления для измерения предварительно стерилизуют и нагревают до температуры 30 0 С, так как резкое охлаждение спермы, в особенности свежеполученной, вызывает холодовый удар и гибель сперматоцитозоидов. Для определения объема эякулята жеребца полученную сперму из спермоприемника процеживают через сложенную вчетверо стерильную марлевую салфетку в теплый (60 0 С) стерильный мерный цилиндр или мензурку и накрывают стеклянной крышкой. Тягучий секрет пузырьковидных желез, оставшийся на марле, выбрасывают, так как он мешает при работе со спермой и снижает жизнеспособность сперматозоидов. Подобным образом измеряют объем эякулята хряка, только с той разницей, что слизистые зерна секрета луковичных желез остаются на фильтре, вставленном в головку спермоприемника перед взятием спермы от производителя. Если фильтра нет, то полученную сперму процеживают через марлевую салфетку. В пластмассовых спермоприемниках объем эякулята можно определить по делениям.
|
|
|
Оценка спермы по густоте. Для исследования спермы под микроскопом от общего объема берут 2 − 3 мл в ермы под микроскопом от общего объема берут 2 − 3 мл в стерильный флакон из-под антибиотиков. Микроскопическая оценка спермы проводится на определение подвижности, концентрации и выживаемости спермиев. Стерильной пипеткой или стеклянной палочкой наносят на чистое сухое предметное стекло каплю спермы и накрывают ее покровным стеклом, переносят на предметный столик микроскопа, помещенный в специальный термостат с температурой 40 − 42 ° С, или на нагревательный столик, и оценивают сперму при увеличении микроскопа в 200 − 300 раз. В одной капле спермы под микроскопом одновременно определяют густоту и подвижность спермиев. Густота спермы, определяемая при глазомерной микроскопической оценке, дает приблизительное представление о количестве спермиев в 1 мл эякулята. Это субъективная оценка, ошибка может достигать 25 − 30 %. Густая сперма (условное обозначение Г) соответствует концентрации 200 млн и больше спермиев в 1 мл – все поле зрения микроскопа густо заполнено спермиями. Средняя сперма (условное обозначение С) соответствует концентрации от 100 до 200 млн спермиев в 1 мл − заметны промежутки между спермиями. Редкая сперма (условное обозначение Р) соответствует концентрации менее 100 млн спермиев в 1 мл − заметны большие промежутки между спермиями. Глазомерная оценка концентрации спермы по густоте расположения спермиев ориентировочна и по ней не может быть установлена степень разбавления спермы (рис. 7, 8, 9).
| 
|
| Рисунок 7 – Густая сперма (Г) | Рисунок 8 – Сперма средней густоты (С) |
| |
| Рисунок 9 – Редкая сперма (Р) |
Сперму исследуют при температуре 38 − 40 ° С, для чего используют термостаты или обогревательные столики.
Оценка спермы по интенсивности дыхания. Приборы и материалы. Микроскоп, стеклянная трубка диаметром 0,8 − 1,0 мм (можно использовать трубку от шприца-катетера), предметные стекла, 2 глазные пипетки, стеклянные палочки, песочные часы, 0,01% раствор метиленовой синьки, белая бумага, салфетки. Активность спермы оценивают по скорости обесцвечивания (восстановления) метиленовой синьки, смешанной со спермой (методика Н. П. Шергина). При дыхании спермии потребляют кислород, растворенный в смеси, в результате этого синька обесцвечивается. Интенсивность дыхания зависит от концентрации и активности спермиев. Спермии, способные к прямолинейно-поступательному движению, имеют более высокую активность жизненных процессов и дыхания. Следовательно, чем выше концентрация спермиев и чем большее их количество способно к прямолинейно-поступательному движению, тем быстрее расходуется кислород, скорее происходит обесцвечивание метиленовой синьки и, соответственно, выше качество спермы. Оценку качества свежеполученной спермы по скорости обесцвечивания метиленовой синьки проводят при температуре 18 − 22 0 С, т.к. понижение температуры замедляет интенсивность энергетических процессов и дыхания спермиев. При снижении температуры на 10 0 С интенсивность дыхания уменьшается примерно вдвое, а при 0 0 С почти прекращается.
Приготовление 0,01% раствора метиленовой синьки. 0,5 г синьки растворяют в 200 мл 1% раствора хлористого натрия и настаивают три дня. Затем готовят рабочий раствор: к 1 части раствора синьки добавляют 9 частей 1% раствора хлористого натрия.
На предметное стекло глазной пипеткой нанести по одной капле краски и спермы и быстро смешать их стеклянной палочкой. Смесь набрать в стеклянную трубочку, чтобы столбик ее был длиной около 2 см. Трубку положить на лист белой бумаги и наблюдать за обесцвечиванием синьки. Обычно она обесцвечивается в середине столбика. На концах столбика могут оставаться голубые кольца, т.к. с концов смесь постоянно обогащается кислородом воздуха. Для оценки качества спермы жеребца и хряка этот метод не используется, поскольку обесцвечивание смеси метиленовой синьки со спермой затягивается до 60 мин.
Определение процента живых спермиев. Приборы и материалы. Микроскоп, обезжиренные предметные стекла, шлифованные покровные стекла, пипетки, стеклянные палочки, раствор эозина, 96 % спирт, салфетки. Оболочка спермиев, у которых энергично протекают обменные процессы, не пропускает в протоплазму лабораторные краски, поэтому живые спермии не окрашиваются. Мертвые и ослабленные с колебательным движением спермии легко пропускают краску внутрь и, следовательно, окрашиваются этой краской. Наличие в сперме мертвых и патологически измененных спермиев снижает качество спермы.
Активность (подвижность) спермы, т. е. процент живых нормальных спермиев, определяют путем ее глазомерной оценки под микроскопом –движущихся и неподвижных спермиев. При этом различают три вида движения спермиев: поступательное – спермии двигаются только по прямой линии вперед; колебательное – спермии не перемещаются, а только изгибаются на одном месте; манежное – поступательное движение спермиев хотя и происходит, но по кругу небольшого диаметра, а не по прямой, как при поступательном движении.
Сперма, в которой спермии имеют только колебательное движение, или кружатся на одном месте, или совсем не обнаруживают движения, непригодна для осеменения.
Для правильной оценки спермы необходимо пользоваться микротермостатом, обогревательным столиком или поставить микроскоп с препаратом спермы в ящик-термостат из фанеры, обогреваемый помещенной в него электрической лампой, которая дает освещение для микроскопа и поддерживает температуру на уровне 38 − 40 ° С. Чтобы поддерживать температуру на определенном уровне, в термостате устраивают вентиляционное окно. Контролируют температуру термометром, вставленным в отверстие термостата.
Активность (подвижность) спермиев оценивают по десятибалльной шкале. Для оценки спермы (сразу после ее взятия) из спермоприемника берут пипеткой или стеклянной палочкой небольшую каплю спермы и осторожно накрывают покровным стеклом. Препарат кладут на столик микроскопа и глазомерно определяют количество (процент) движущихся спермиев. При оценке 9 баллов – 90 % спермиев имеют прямолинейное поступательное движение; 8 баллов – 80 % и т.д.спермиев. Если один спермий с прямолинейным поступательным движением приходится на несколько неактивных (мертвых, с манежным и колебательным движением), активность (подвижность) спермиев обозначают буквой К; сперма, в которой спермии совсем не движутся, обозначается буквой Н (некроспермия). В журнале (карточке) по использованию производителя окончательная оценка спермы обозначается по двум показателям: густоте спермы (количеству спермиев) и подвижности спермиев (рис. 10).
Высшую оценку (10 баллов) получает сперма, в которой практически почти все (100 %) спермии имеют прямолинейное поступательное движение.
Например, Г-10 – сперма густая, около 100 % спермиев с прямолинейным поступательным движением; С-8 – сперма средняя, около 80 % спермиев имеют прямолинейное поступательное движение.
Спермии с поступательным движением Спермии мертвы
Рисунок 10 – Оценка спермы по подвижности спермиев: а – 10 баллов; б – 8 баллов; в – 6 баллов; г – 4 балла; д – 2 балла; е – Н (некроспермия)
Различие живых и мертвых спермиев по окраске. Этот объективный метод впервые был предложен В. А. Морозовы и основан на том, что живые спермии, способные поступательно двигаться, не воспринимают красок. Мертвые же спермии, а также, по-видимому, с колебательным движением легко окрашиваются.
Техника определения количества мертвых и живых спермиев заключается в следующем. На обезжиренное спиртом и эфиром предметное стекло наносят небольшую каплю спермы, добавляют к ней каплю 5 % водного раствора эозина, 1 − 2 с перемешивают стеклянной палочкой и делают тонкий мазок, чтобы он высох в течение минуты. Все это надо выполнять очень быстро, чтобы живые спермии не погибли и не восприняли окраску, прежде чем высохнет мазок.
Высохший мазок немедленно просматривают под микроскопом. Спермии, бывшие в момент смешения с краской живыми, хорошо выделяются на розовом фоне своей белой неокрашенной головкой. Мертвые спермии окрашиваются в розовый цвет. Производят подсчет 500 спермиев подряд, отмечая при этом число окрашенных, и вычисляют процент живых и мертвых спермиев. При навыке этот способ дает точные результаты и заслуживает широкого распространения.
Определение содержания патологических форм спермиев. Определение числа уклоняющихся (патологических) форм спермиев имеет большое практическое значение, так как при значительном количестве в эякуляте таких спермиев резко снижается оплодотворяющая способность спермы (рис. 11).
Рисунок 11 – Нормальные и уклоняющиеся (патологические) формы спермиев:
1 – нормальные; 2 – гигантские и карликовые; 3 – с деформацией головки; 4 – с надломом шейки; 5 – свободные (но нормальные по форме) и бесхвостные спермии; 6 – с закручиванием и ненормальным искривлением хвоста; 7 – спермии с каплей и утолщением хвоста; 8 – прочие патологические формы
Азооспермия – отсутствие спермиев в эякуляте. Олигоспермия – в сперме имеется небольшое количество спермиев, иногда с хорошей подвижностью, но плохой выживаемостью. Некроспермия – неподвижность спермиев в свежеполученной сперме. Тератоспермия – появление большого количества патологических спермиев.
Даже в хорошей сперме можно обнаружить спермии, уклоняющиеся в своем строении от нормы: гигантские и карликовые, с деформацией головки, двумя головками, с надломом у шейки, двухвостые, спермии с неправильным телом и закрученным хвостом и т. д. Наличие в эякулятах большого числа уклоняющихся (патологических) форм спермиев свидетельствует о заболевании семенников, выводящих путей и придаточных половых желез.
Способы подготовки обезжиренных стекол. 1. Чистые стекла выдерживают в смеси спирта и эфира (соотношение 1:1) в течение суток. Затем извлекают и протирают насухо. 2. После тщательного мытья в растворе детергента предметные стекла промывают в дистиллированной воде, протирают, заворачивают в бумагу – и выдерживают в сушильном шкафу не менее 30 минут. 3. Полевой способ. На холодную поверхность электроплиты помещают в один слой чистые стекла. После того как стекла раскалятся, плиту выключают. Дают стеклам остыть. Рецепт краски. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 1,7 г эозина и 3 г цитрата натрия. На обезжиренное предметное стекло нанести 1 каплю семени и 1 − 2 капли краски эозина. Капли смешать и ребром шлифованного стекла сделать тонкий ровный мазок. Он должен быстро высохнуть на воздухе. Активные спермии, сохранившие избирательную способность мембран, отталкивают краску и не окрашиваются, неактивные окрашиваются в красный или розовый цвет. Просмотреть мазок под микроскопом. В каждом поле зрения следует подсчитать количество нормальных и патологических, или живых и мертвых, спермиев. Рекомендуется подсчитать не менее 500 спермиев. Вычисляют процент неактивных спермиев, он не должен превышать у барана – 14, быка – 18, у жеребца и хряка – 20.
Определение концентрации спермиев в сперме. Количество спермиев в полученном эякуляте более точно можно определить посредством счетных камер с сеткой Тома, Горяева, Бюркера и Ключарева − Предтеченского, применяемых в медицинской практике для подсчета форменных элементов крови (рис. 12).
1 2
3
Рисунок 12 – Сетка счетных камер: 1 – Тома, 2 – Горяева, 3 – Бюркера
Камеры состоят из толстого стекла с нанесенными на нем поперечными прорезями, образующими три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена на две, каждая из которых имеет выгравированную на ней сетку. По обе стороны средней площадки расположены две другие, которые на 0,1 мм выше средней. Плоскости этих площадок служат для притирания покровного стекла.
Когда покровное стекло плотно притерто к предметному стеклу до появления радужных колец, на месте выгравированной сетки создается камера, закрытая с двух сторон. С других двух сторон остаются капиллярные щелевидные отверстия, через которые камеру заполняют спермой.
Счетные камеры различаются между собой размером площадки сетки и группировкой квадратов. Постоянной резиновую трубку, лаборант насасывает необходимое количество спермы, обтирает кончик смесителя мягкой чистой салфеткой, а затем набирает в него 3 % раствор хлористого натрия, который умерщвляет спермиев и разбавляет сперму, что облегчает подсчет (рис. 13, 14).
| 
|
| Рисунок 13 – Счетная камера для подсчета спермиев: 1– предметное стекло, 2 – опорные стеклянные пластинки, 3 – стеклянная пластинка с сеткой, 4 – желобок, 5 – покровное стекло | Рисунок 14 – Заполнение сетки счетной камеры для подсчета спермиев |
Затем оба конца смесителя зажимают пальцами (большим и указательным правой руки) и в течение 2 − 3 мин переворачивают его вверх и вниз (встряхивают). Находящаяся в смесителе сперма смешивается с раствором хлористого натрия. После этого из смесителя выпускают четыре-пять капель эритроцитный меланжер. Внутри него обычно находится красная бусинка. Эритроцитный меланжер позволяет разбавлять сперму в 100 или 200 раз. На стенке имеются деления – метки: 0,5; 1,0 и 101. Второй меланжер лейкоцитный. Внутри него находится белая бусинка. Этим меланжером сперму разбавляют в 10 − 20 раз; его применяют для разбавления более редкой спермы (хряка, жеребца).
Подготовка спермы к подсчету спермиев в счетной камере. Перед тем как набрать сперму в смеситель, на верхний его конец, имеющий расширение, надевают резиновую трубку. Кончик смесителя обтирают чистой салфеткой и наносят каплю спермы на среднюю пластинку камеры. По щелевидным капиллярным отверстиям сперма проникает под покровное стекло и заполняет сетку. При этом на сетке камеры не должно быть воздушных пузырей, так как это мешает точности подсчета.
Подсчет спермиев. Концентрация спермиев выражается числом их в
1 мм3 спермы в миллионах или в 1 мл спермы в миллиардах и обозначается буквой С. Для определения концентрации спермиев заполненную спермой счетную камеру осторожно переносят на предметный столик микроскопа, который должен иметь горизонтальное положение. При слабом увеличении на стекле находят сетку. Спермии подсчитывают при таком увеличении (в 400 − 600 раз), чтобы в поле микроскопа помещался один большой квадрат. В счетной камере Тома спермии подсчитывают в четырех больших квадратах, расположенных по диагонали сетки, и в одном квадрате в углу (рис. 15).
Рисунок 15 – Порядок подсчета спермиев в одном квадрате
В камерах Горяева и Ключарева − Предтеченского спермии подсчитывают в пяти больших квадратах, расположенных по диагонали сетки, считая в каждом квадрате 16 малых квадратиков. Таким образом подсчитывают спермии, находящиеся в 80 малых квадратиках.
При пользовании счетной камерой с сеткой Бюркера число спермиев подсчитывают в 80 малых квадратах, начиная сверху. Один малый квадрат в правом нижнем углу не принимают во внимание.
В каждом маленьком квадратике подсчитывают спермии, головки которых лежат в данном квадратике и размещены на верхней и левой линиях квадрата. Спермиев, расположенных на нижней и правой линиях, в число спермиев данного квадратика не включают. Число спермиев каждого квадратика записывают, а затем складывают. Для подсчета удобно пользоваться счетчиками для форменных элементов крови. Затем производят пересчет числа спермиев в 1 мм3. Так как площадь каждого маленького квадратика составляет 1/400 мм2, то для перевода на 1 мм2 следует подсчитанное в 80 малых квадратиках число спермиев умножить на 5, а для перевода на 1 мм3 – еще на 10 (так как глубина камеры 0,1 мм) и, наконец, на степень разбавления. Для определения числа спермиев в 1 мл (1 см3) число их в 1 мм3 умножают на 1 000.
Расчет числа спермиев производят по формуле
,
где n – число подсчитанных спермиев; Д – степень разбавления; N – число сосчитанных малых квадратов (80); р – глубина камеры, мм.
Множитель 400 введен в формулу потому, что площадь малого квадратика равна 1/400 мм2. Следовательно, для перевода на 1 мм2 необходимо подсчитанное число спермиев умножить на 400. Полученная в формуле величина С (концентрация спермиев) разделена на 1 000 000, поэтому получается содержание спермиев в миллионах на 1 мкл (мм3), или, что то же, в миллиардах на 1 мл (см3).
Чтобы получить более точные данные, при определении концентрации спермиев рекомендуют повторить смешение и подсчет спермиев произвести дважды. Расхождение результатов должно быть в пределах не более 10 %. Если оно больше 10%, то производят подсчет в третий раз и берут среднее из двух подсчетов, расходящихся не более чем на 10 %.
Для определения концентрации спермиев в сперме жеребца во Всесоюзном научно-исследовательском институте коневодства разработаны стандарты. Стандарты представляют собой шесть запаянных пробирок, в которые налита жидкость, имитирующая сперму жеребца. В каждой пробирке жидкость по мутности соответствует сперме с концентрацией в 10, 50, 100, 200, 300 и 500 млн спермиев в 1 мл. К стандартам приложены две пустые пробирки такого же диаметра, как и пробирки с жидкостью.
Определение концентрации сперматозоидов по стандартам производится следующим образом: в пустую пробирку наливают сперму и просматривают на свет, сравнивая со стандартными пробирками. Подбирают стандарт, наиболее близкий по мутности к определяемой сперме, и указанную на пробирке концентрацию принимают за концентрацию исследуемой спермы. Может быть и промежуточная концентрация, например 75 млн (мутнее 50, но прозрачнее 100). Если сперма густая и концентрация спермиев больше 500 млн в 1 мл, то ее можно разбавлять глюкозной средой в 2 раза и затем определить ее концентрацию по стандартам, умножив на 2 полученный результат.
К комплекту стандартов приложена стеклянная палочка, которую прикладывают к обратной стороне просматриваемых пробирок. По степени видимости палочки удобнее установить сравнительную степень мутности спермы и стандартов.
Определение концентрации спермиев с помощью фотоэлектроколориметра. В лабораториях племпредприятий (станций) по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных для определения концентрации спермиев пользуются фотоэлектроколориметром ФЭК-4. Методика пользования фотоэлектроколориметром дается в прилагаемом к прибору руководстве.
Пользуясь фотоэлектроколориметром, можно легко и быстро определить концентрацию спермиев в сперме. На исследование одной пробы спермы затрачивается не более 2 − 3 мин, что позволяет, не задерживая технической обработки, определить концентрацию спермиев каждого эякулята, поступающего в лабораторию. Фотоэлектроколориметрический метод определения концентрации спермиев в сперме основан на способности спермы ослаблять пропускаемый через нее пучок света пропорционально ее концентрации. Чем выше концентрация спермиев в сперме, тем сильнее ослабляется пучок света. Применение приборов, способных регистрировать изменения силы светового пучка в относительных единицах, позволяет судить о величине концентраций исследуемых образцов спермы.
Концентрацию спермиев можно определить также при помощи эритрогемометра.
Определение абсолютного показателя выживаемости спермиев. Абсолютный показатель выживаемости спермиев определяется с помощью разведения спермы. Сперму, разбавленную в различное число раз, хранят при 0 ° С (с предосторожностями против шока при охлаждении). Для разбавления употребляется синтетическая среда, например глюкоза безводная – 30 г для быка и 8 г для барана, натрий цитрат 3-замещенный 5-водный – 14 г для быка и 28 г для барана, желток куриного яйца – 120 мл для быка и 150 мл для барана, вода – 1 л. Можно пользоваться и другой средой.
Различные разбавления спермы готовят так. В 11 пронумерованных мелких пробирок наливают: в 1-ю – 0,5 мл неразбавленной спермы, а в остальные 10 – по 0,5 мл синтетической среды. Затем во 2-ю пробирку приливают 0,5 мл неразбавленной спермы. Перемешав содержимое 2-й пробирки, из нее берут 0,5 мл смеси и переносят в 3-ю пробирку. Перемешав, из 3-й пробирки берут 0,5 мл смеси и переносят в 4-ю пробирку и так продолжают до последней. Получается в 1-й пробирке неразбавленная сперма, а в остальных – разбавленная в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 и 1024 раза (из последней 11-й пробирки 0,5 мл смеси выливают). В пробирках сразу же и в последующие дни ежедневно проводят оценку активности спермиев (в одно и то же время). Оценку проводят под микроскопом при 40 °, смешивая при этом каплю спермы из пробирки с каплей 3% цитрата.
Оценки проводят до прекращения поступательного движения спермиев. Абсолютный показатель выживаемости (S) вычисляют по формуле
S=Σat,
где Σ – знак суммы; а – активность спермы; t – показатель времени, подсчитанный по формуле
,
где Tn+1 – часы от начала опыта до следующего определения; Tn − 1 – часы от начала опыта до предыдущего определения.
Вычисления производят для каждого определения и получают суммы.
Хорошая сперма быка и барана должна иметь абсолютный показатель выживаемости спермиев при разбавлении спермы в 16 − 32 раза не ниже
1 400 (может быть 3600 и выше), сперма хряка – не ниже 900, сперма жеребца – не ниже 400.
Количественное определение содержания лецитиновых зерен. Для точного количественного определения содержания лецитиновых зерен применяется следующая методика: полученный материал вдвое разводится дистиллированной водой с добавлением 1 капли метиленового синего для лучшей дифференциации лецитиновых зерен. После тщательного перемешивания капля образованной взвеси переносится в камеру Горяева. Производится подсчет лецитиновых зерен в 100 больших квадратах, что соответствует 1 600 маленьким квадратам. Для подсчета используется формула
X=Y×4000×1000×2/1600=Y×5000,
где Х – число лецитиновых зерен в 1 мл эякулята, Ү – число лецитиновых зерен в 100 больших квадратах камеры Горяева, 1 600 – число малых квадратов в 100 больших, 1/4000 – объем одного малого квадрата. Для определения количества лецитиновых зерен в 1 мл эякулята необходимо число лецитиновых зерен в 1 мл камеры Горяева умножит на 5 000.
Спермограмма – исследование эякулята (спермы) мужчины под микроскопом. Это основной и фактически единственный анализ, который позволяет оценить способность мужчины к зачатию ребенка. Но при этом также следует заметить, что никакое отклонение от нормы показателей спермограммы не может означать полной невозможности зачатия. Любые отклонения показателей спермограммы от нормы могут вести лишь к снижению вероятности зачатия естественным путем, но никак не к полному отсутствию такой вероятности.
Техника исполнения анализа. Эякулят оценивают внешне на глаз, затем наносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом.
Значение результатов анализа.
Объем эякулята. Норма − 3 − 5 мл. Снижение объема эякулята чаще всего свидетельствует о недостатках транспортировки материала и поэтому большого диагностического значения не имеет. Если на исследование доставлен весь полученный материал и выявляется снижение его объема, это может свидетельствовать о недостаточной функции половых желез – предстательной железы, семенных пузырьков и некоторых других, что в свою очередь может быт
|
|
|
