Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Организация геномов нематод




Кратко:

Развитие каждой клетки нематод жестко детерминировано. Геном нематоды (С.elegans) имеет размер 100млн.н.п

Последовательность генома собрана из:

· число генов 1900

· ген РНК- 877 мРНК

· геном был секвенирован с использованием космид – 17 000 и дрожжевых хромосом -3 000 YAC последовательностей

Доменная организация белков:

1) большинство генов используется в клетках коммуникации (G –белки, рецепторы)

транссплайсинг -способность считывать информацию со внутренних рамок считывания, путем разрезания по механизму сплайсинга

· в 1 гене – 6 экзонов (размер 300 н.п) и размер интронов (57 н.п)

· средний размер гена – 2 тыс н.п

· 27 % кодирующей ДНК

 

Первым из беспозвоночных был идентифицирован геном нематоды Caenorhabditis elegans. Существует огромное разнообразие нематод. Это один из наиболее широко представленных в окружающей среде типов животных. В каждом кубическом сантиметре почвы может содержатся до нескольких миллионов особей. Нематоды могут обитать в почве, в воде, на или в различных организмах. Среди нематод есть много паразитов. Нематоды встречаются и в ледниках Антрактиды (в анабиозе). План организации тела нематод является достаточно удачным для многоклеточных животных. Но такой план организации тела специфичен и стоит особняком от организации тела других многоклеточных животных. Но самой главной отличительной особенностью нематод является то, что план строения тела очень жестко детерминирован и программа развития организма прописана с точностью до одной клетки. Лет 30 назад Сидни Бренер сделал нематоду модельным организмом, до этого нематод практически никто не изучал. Как только выяснилось, что у них очень жесткая программа развития, Бренер решил, что нужно отрабатывать молекулярно биологические методики на нематодах и секвенировать геном этого организма. Благодаря Бренеру уже к концу 80-х годов было полностью известно, как развивается этот организм, была построена карта развития нематоды.

Организм нематоды состоит приблизительно из 936 клеток. Точно известно, из какой клетки какая образуется, как формируется каждый орган и сколько в нем клеток. Особый интерес этот организм вызывал в связи с тем, что точно известны особенности организации нервной системы. Нервная система нематоды состоит из 300 нейронов. Досконально известно, как формируется и развивается нервная система нематоды. Ученые пытались определить, каким образом работает эта нервная сеть. Такое относительно небольшое число нейронов можно изучать как функционирует самый примитивный биологический компьютер. Такие исследования интенсивно ведутся, но пока результаты этих исследований еще не дошли до относительно популярной литературы. Они слишком специфические, математизированные и компьютиризованные, чтобы в них можно было нормально разобраться. Этот организм позволяет на молекулярно биологическом уровне работать с конкретными «вещами», потому что четко известно, что каждая клетка в организме делает. У других организмов (человек) каждый орган состоит из неопределенного количества клеток (+- 30% клеток). Кроме того нематоды имеют очень компактный геном (всего 100 млн нуклеотидных пар).

На сегодняшний день геном нематод является минимальным геномом многоклеточного организма, который секвенирован. Нематода была первым отсеквенированным многоклеточным организмом. При секвинировании генома нематоды в основном использовалась космидная библиотека, потому что на момент старта геномного проекта еще не было разработано дрожжевых искусственных хромосом. К концу геномного проекта уже появляются дрожжевые искусственные хромосомы, но все-таки основная масса сиквенса, как показывает данная схема, была сделана на космидных клонах. ЯКи были добавлены потом, они помогли состыковать космиды между собой. Основная масса секвинирования осуществлялась с помощью космид. Размеры ЯК- клонов очень небольшие. Они представляют собой не мегабазные вставки, а вставки размером приблизительно пару сотен нуклеотидных пар. Стандартный размер космиды – 45000 пар нуклеотидов. Такие клоны с небольшим размером вставки оказываются относительно стабильными.

Геном нематоды Caenorhabditis elegans был состыкован из 2,5 тысяч космид, 113 фазмид и 257 ЯК-клонов. С теми последовательностями, которые никак не удалось состыковать, проводилась модифицированная ПЦР. Модифицированная ПЦР позволяет «отПЦРить» несколько десятков нуклеотидных пар. В результате еще в 1998 году был получен геном первого эукариотического организма, качество которого для эукариот остается до сих пор непревзойденным. Во-первых отсеквинирован практически весь геном, в отличие даже от человеческого генома. В сиквенсе генома нематоды Caenorhabditis elegans содержится меньше всего «дырок». Это стало возможным благодаря тому, что у нематод относительно мало гетерохроматина (практически нет гетерохроматина) и геном нематод маленький. Удалось «прочитать» значительную часть гетерохроматина нематод. Осталось менее 1% несеквенировано. Начиная с первого одноклеточного генома, процент недосеквенирования только рос. На момент публикации генома человека около 10% генома оставалось недосеквенированным. Сейчас остается недосеквенированным более 1% генома.

Около четверти генома Caenorhabditis elegans являются кодирующей частью генома. В данном геноме относительно немного геномных повторов.

Геном нематоды Caenorhabditis elegans включает приблизительно 19000 генов, кодирующих белок. К сожалению, нематоды стоят особняком и гомология с генами других организмов совсем невысокая. На момент завершения геномного проекта были понятны функции только 40% генов нематоды Caenorhabditis elegans (т. е. 40% генов нематоды более или менее совпадали с функционально охарактеризованными генами других организмов). По современным данным 24% белков нематоды не имеют функциональной гомологии. 34% генов нематоды Caenorhabditis elegans имеют гомологию с генами нематод, секвенированных позднее. Однако такая гомология не способствует пониманию функциональной роли данных генов (белков) Caenorhabditis elegans. В результате функции почти 60% (24% + 34%) генов Caenorhabditis elegans остаются неизвестными. 34% генов Caenorhabditis elegans имеют гомологию с другими представителями класса нематод, но такая гомология никак не помогает пониманию функций соответствующих генов. В настоящий момент только у 40% всех генов Caenorhabditis elegans можнопредполагать какую-либо смысловую нагрузку. Геном нематоды характерен тем, что достаточно много (более 1000) генов не кодируют белок. Эти гены не являются «мусором», а необходимы нематодам. Большинство данных генов кодируют транспортную РНК (почти 900 генов). Минимум генов транспортных РНК, необходимых организму, - 43 или 44 тРНК в зависимости от модификации генетического кода и с учетом нестрого взаимодействия. Есть варианты, когда генетический код немного модифицируется и количество генов тРНК снижается. Любой организм, даже прокариотический, имеет избыток генов тРНК. У эукариот такая избыточность может быть значительной. Эта высокая избыточность генов тРНК у эукариот способствует тому, что оптимальный спектр используемых кодонов очень существенно варьирует у различных эукариот. Чем больше транспортных РНК, соответствующих определенному кодону, тем эффективнее идет трансляции соответствующих кодонов. Если какому-то кодону соответствует всего лишь одна тРНК, то трансляции будет идти очень неэффективно. При попытке экспрессии чужеродного гена в соответствующем организме необходимо учитывать оптимальные кодоны, имеющиеся в этом организме. Но в некоторых случаях не надо обращать на это внимание, потому что трансляция все равно будет эффективной. Следует учитывать, из какого организма взят ген и в какой организм он вводится. Если стандартный ген E. coli ввести в растение, то оптимизация кодонного состава повысит экспрессию только в 1,5 раза и поэтому в данном случае оптимизация кодонного состава не имеет смысла. Если стандартный ген E. coli ввести в животное, то он будет очень плохо экспрессироваться.

В геноме Caenorhabditis elegans от генов тРНК берут свое начало почти 200 псевдогенов (т. е. уже инактивированных генов тРНК). В сумме семейство генов тРНК содержит больше тысячи генов, это семейство генов составляет значительную часть генома Caenorhabditis elegans. Следующий класс не кодирующих белок генов – это малые ядерные РНК. Малые ядерные РНК входят в состав сплайсосомы. Малые ядерные РНК содержатся в U-частицах, которые вместе формируют сплайсосому. Сплайсосома – это крупный рибонуклеопротеиновый комплекс, который занимает существенный процент массы клетки. Для того, чтобы получить нормальный уровень сплайсосомных частиц и чтобы сплайсинг происходил эффективно, обычно клетка имеет множественные дупликации этих генов (от 5 – 20 генов). SRP (signal recognition particle) - это частица, которая обеспечивает направление секретируемого пептида в полость эндоплазматического ретикулама. В состав SRP входят 7S РНК (больше 300 нуклеотидных пар) и 6 белков. Частиц SRP в клетке достаточно много, поэтому и соответствующие гены дублируются. Еще два важных класса РНК – это SL1 и SL2 РНК. S1 и S2 РНК специфичны только для нематод. У каждого организма гены рРНК несколько по-разному организованы. Гены рРНК чаще всего располагаются целым кластером на одной хромосоме или могут быть диспергированы по геному несколькими кластерами (отдельными генами). Но обычно это один крупный кластер на одной хромосоме. У Caenorhabditis elegans кластер генов рРНК располагается на первой хромосоме.

Наиболее часто встречающиеся белковые домены Caenorhabditis elegans являются трансмембранными рецепторами с семи трансмембранными доменами, которые представлены несколькими семействами (3 семейства). Такие рецепторы имеют больше тысячи доменов и кодируются еще большим числом генов. Около двух тысяч генов Caenorhabditis elegans кодируют рецепторы. Значительное количество кодирующих рецепторы генов является принципиальным отличием от одноклеточных эукариот. У дрожжей тоже есть рецепторы, но их совсем мало (пару сотен на 1 клетку). Такая ситуация очень четко показывает наиболее принципиальное отличие в организации многоклеточного организма на молекулярном уровне от таковой у одноклеточных. Необходима четкая межклеточная коммуникация и координация согласованного действия всех клеток многоклеточного организма, что требует наличия нормальных систем коммуникации. Для функционирования таких систем коммуникации нужны рецепторы. В данной таблице нет генов, которые отвечают за синтез соответствующих лигандов. Для каждого рецептора существует свой лиганд. В геноме многоклеточного организма должны содержатся кодирующие лиганд гены, в количестве (как минимум) равном количеству генов рецепторов. В геноме многоклеточного организма должны присутствовать контролирующие синтез рецептора и лиганда гены и гены, обеспечивающие передачу сигнала от рецептора к ядру. В итоге получается, что, как минимум четверть всего протеома клетки многоклеточного организма отвечает исключительно за межклеточную коммуникацию.

Нематоды уникальные организмы (но сейчас показано, что есть и другие осуществляющие транссплайсинг организмы: трипанасомы, и т.д.), т. к. у них происходит транссплайсинг. На нематодах впервые было показано, что у эукариот может быть оперонная организация. Около 25% всех генов Caenorhabditis elegans «упакованы» в опероны, но опероны эукариот имеют проблему с инициацией трансляции внутренних рамок считывания. Даже если в первичный транскрипт будет сплайсирован, то только трансляция данной рамки будет происходить нормально. Инициация трансляции на выходе невозможна, т. к. нет механизма, который используется у прокариот, типа трансляционного сопряжения, либо внутренней последовательности Шайна-Дальгарно. Кроме того, в малой субъединице рибосомной РНК нет соответствующего комплементарного участка, т. е. 16S РНК имеет делецию 5 нуклеотидов, которые соответствуют прокариотической последовательности Шайна-Дальгарно. Каким-то образом должна быть обеспечена инициация трансляции на внутренних рамках считывания. Эта проблема решается достаточно просто. За счет транссплайсинга к внутренним рамкам точно также, как и у трипанасомы к любой рамки, пришивается кепированная лидерная РНК. Единственная модификация данного процесса у нематод заключается в том, что у нематод есть две лидерных РНК. SL1 РНК точно такая же как и у трипаносом, она пришивается к самому началу транскрипта. А SL2 РНК присоединяется к внутренним рамкам. Сейчас показано, что у многих беспозвоночных животных (даже у представителей класса хордовых) осуществляются процессы трансплайсинга, которые позволяют иметь оперонную организацию. У низших хордовых показано наличие транссплайсинга. Возможно, даже у человека есть системы транссплайсинга, но пока нет экспериментальных данных подтверждающих это. Скорее всего процессы транссплайсинга имеют более широкое распространение, чем мы себе представляем.

В организме Caenorhabditis elegans очень легко проходит РНК-интерференция. Существует множество методов индукции РНК-интерференции. Первоначально такую индукцию проводили за счет инъекции интерферирующей молекулы РНК в нематоду. Но такой способ трудно технически осуществить, т. к. организм нематоды мелкий. Совершенно случайно открыли, что можно замочить нематоду в растворе РНК. Можно также накормить нематоду бактериями, которые экспрессируют интерферирующую РНК. Те методы, которые запустили развитие этих технологий, связаны с кормлением нематоды бактериальным газоном, клетки которого экспрессируют соответствующую интерферирующую РНК.

На момент выхода только этих геномов был сделан интересный анализ «на кого больше всего похожа нематода?». Тогда было отсеквенировано лишь небольшое число геномов (дрожжи, E. coli и т. д.). В результате получилось, что нематода больше всего похожа на Homo sapiens.

31. Организация генома Drosophila melanogaster

Кратко:

· Размер генома -180 млн. н.п (120 Mb –эухроматин; 60 –гетерохроматин)

Эухроматин – беден генами, богат транспозонами и др. повторами, интенсивно окрашивается, окружает центромерные области

· Геном богат повторами => используется 3 типа библиотек

А) мультикопийные плазмиды со вставками размеров 2 kb

Б) плазмиды со вставками размером 10 kb

В) 130 kb ВАС-клоны секвенированы с концов и использованы для стыковки фрагментов генома между собоц

· В геноме 14 тыс генов

· Экзонв 4-5 (размер 150 н.п)

· Интроны (60 н.п)

· Средний размер гена 3800 н.п

· 19 % кодирующей ДНК

Первым из членистоногих был отсеквинирован геном дрозофилы. Дрозофила – очень удобный экспериментальный объект. На момент начала геномного проекта 2,5 тысяч генов уже было охарактеризовано, клонировано, секвенировано и нанесено на генетическую карту. Генетические карты дрозофил существуют примерно сто лет (1913 г). Сиквенс генома дрозофилы был сделан под руководством Вентера.

Дрозофила оказалась удачным объектом для секвенирования и сточки зрения геномики, т. к. она имеет очень компактный геном (всего 180 млн нуклеотидных пар).

Геном дрозофилы является самым небольшим среди известных геномов членистоногих. Около трети генома дрозофилы существует в виде гетерохроматина. В связи с тем, что гетерохроматиновые участки вообще не клонируются в бактериальных векторах (токсичны для них), Вентер не сиквенировал гетерохроматин дрозофилы. Т. к. в гетерохроматине содержится только небольшое количество генов, решение Вентера является достаточно обоснованным. После секвенирования генома дрозофилы никто и не пытается сначала клонировать и изучать гетерохроматиновые участки. В первую очередь секвенируется эухроматиновая часть генома, а только потом, по возможности, пытаются с концов «вгрызца» в гетерохроматин. У дрозофилы есть всего 2 больших аутосомы, половые хромосомы (Х и У хромосомы) и одна маленькая аутосома. Маленькая аутосома содержит большое количество гетерохроматина. У хромосома почти полностью состоит из гетерохроматина. Небольшое количество хромосом у дрозофилы также значительно облегчило осуществление данного геномного проекта. В геноме дрозофилы имеется больше повторов, чем у Caenorhabditis elegans и фракция кодирующего генома значительно меньше, что представляло проблему для расшифровки генома. Поэтому Вентер использовал модификацию шотган-подхода.

Основная часть сиквенса осуществлялась с использованием pUC со вставками приблизительно 2000 нуклеотидных пар и библиотеки такого же типа, но с более крупными вставками (10000 нуклеотидных пар) и векторами меньшей копийности, чем pUC. Копийность векторов с большими вставками следует снижать, чтобы избежать гибели значительной части клеток, содержащих такие векторы. Для секвенирования генома Caenorhabditis elegans также использовалась библиотека на основе БАКов (бактериальные искусственные хромосомы). БАКи стабильно «держат» вставки приблизительно 100000 – 150000 (иногда даже до 300000) нуклеотидных пар. Обычно в геномных проектах такие вставки составляют от 100 до 150 тысяч нуклеотидных пар. В данном случае средний размер вставки в БАКах составлял 120 -130 тысяч нуклеотидных пар. Библиотека на основе БАКов использовалась для «стыковки» фрагментов генома между собой, в пределах концов каждого БАКа. Поскольку известно, что два таких сиквенса принадлежат к концу одного фрагмента размером 130000 нуклеотидных пар, можно было «состыковать» различные контиги между собой. Таким образом, становилось понятно, какие фрагменты ДНК нужно прицельно секвенировать на стадии финиширования. Кроме того с БАКами проводилось STS-картирование. Вентер использовал уже имеющиеся физические карты и сделал STS-карту генома дрозофилы, используя БАК библиотеку в качестве реагента для картирования. Тогда STS-маркеры было достаточно легко секвенировать, потому что значительная часть генома дрозофилы на тот момент уже была секвенирована. В данном геномном проекте активно использовалась очень старая карта политенных хромосом, карта политенных хромосом дрозофилы, которая была сделана в 30-е года 20 века (позже она была насыщена). К моменту осуществления геномного проекта была произведена привязка некоторых БАКов за счет FISH гибридизации (флуоресцентная гибридизация in situ). Карта политенных хромосом была сделана с достаточно высоким двадцатикилобазным разрешением (очень хорошее разрешение) с привязкой ключевых локусов, что потом существенно упростило сборку всего генома. Основными ресурсами для физического картирования являются STS-карта, карта политенных хромосом, карта на основе БАК библиотеки (позволяет состыковать фрагменты). Окончательную стыковку и завершение физической карты удалось сделать при черновом секвенировании, на БАК библиотеке было сделано приблизительно полуторакратное перекрытие генома, что позволило закончить полную физическую карту генома дрозофилы.

 

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...