26.Молекулярно-генетический метод, его современные возможности и перспективы использования в медицине.

26. Молекулярно-генетический метод, его современные возможности и перспективы использования в медицине.

Молекулярно-генетические методы - большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК. Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. На практике чаще используют лейкоциты, хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов данной группы. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных исследований и может долго сохраняться в замороженном виде. Во многих случаях для успешной диагностики болезни достаточно исследовать небольшой фрагмент генома. Выделение таких фрагментов стало возможным благодаря открытию ферментов - рестриктаз, которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах.

Различают прямую и косвенную ДНК-диагностику моногенных наследственных болезней.

При прямой диагностике предметом анализа являются мутации гена. В ДНК-диагностике в настоящее время используются разнообразные прямые методы. Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов ДНК, которые выявляются при электрофоретическом анализе. Для выявления точковых мутаций, небольших делеций и инверсий в исследуемых генах используют методы, при помощи которых можно проанализировать уникальную последовательность ДНК. Примером может служить метод секвенирования - определение нуклеотидной последовательности ДНК. Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямогосеквенирования мутантной ДНК. Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, этот метод с успехом применяется как основной метод сканирования мутаций. Главное преимущество прямых методов диагностики - почти 100 % эффективность.

Основной недостаток прямых методов состоит в том, что для их применения требуется знание точной локализации патологического гена в геноме, его экзон-интронной структуры и спектра его мутаций. Такая информация на сегодняшний день доступна далеко не для всех моногенных болезней человека.

Косвенное выявление мутаций применяется в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще не известна, но имеется представление о положении гена на генетической карте. Косвенная ДНК-диагностика сводится к анализу полиморфных генетических маркеров у больных и здоровых членов семьи. Маркеры должны быть расположены в том хромосомном регионе, где и ген болезни. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких аллельных вариантах. Отличия могут быть по составу нуклеотидов, по числу динуклеотидных повторов. На основе вариабельности маркерных участков ДНК можно дифференцировать материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера, сцепленного с геном болезни. Благодаря анализу полиморфных генетических маркеров можно определить и проследить в поколениях хромосому, несущую патологический ген. Технические приемы в косвенной диагностике те же, что и в прямой диагностике (получение ДНК, электрофорез и другие). Главный недостаток косвенных методов диагностики - обязательное предварительное изучение генотипа как минимум одного пораженного родственника.

Косвенные методы не требуют знания структуры гена и спектра мутаций в нем. Необходимо только иметь сведения о его локализации. В этом состоит основное преимущество этих методов. Кроме того, методы косвенной диагностики информативны практически для всех обратившихся семей, поскольку всегда есть возможность среди полиморфных маркеров, сцепленных с локусом заболевания, найти информативный для данной семьи.

Методы молекулярной генетики позволяют:

•      идентифицировать мутации в гене. Примером выявления мутантного гена является диагностика серповидно-клеточной анемии в эмбриональном периоде. Фрагменты ДНК, полученные при действии рестриктаз у здорового и больного, сравниваются с помощью метода гибридизации по Саузерну, при этом в качестве зонда используется радиоактивно меченая ДНК гена Р-глобина;

•      диагностировать моногенное наследственное заболевание путем определения нуклеотидной последовательности генов (гемофилия, гемоглобинопатия) и выявления мутантных генов (фенилкетонурия, муковисцидоз);

•      осуществлять генетический анализ полиморфизма ДНК родителей и детей;

•      определять индивидуальную изменчивость ДНК человека по вариабельным точкам ДНК, молекулярный анализ которых по-зволяет проводить идентификацию личности человека);

•      выделять и синтезировать гены (выделение, синтез и кло-нирование генов является одним из этапов генной инженерии):

а)    выделение генов: получение определенных фрагментов ДНК с помощью рестриктаз: разделение фрагментов по молекулярной массе и электрическому заряду —» определение длины фрагмента —> выявление нуклеотидной последовательности данного гена;

б)    синтез генов (варианты): химический синтез — синтез опре-деленных последовательностей нуклеотидов, соответствующих данному гену (используют генетический код и по известной последовательности аминокислот химическим путем синтезируют последовательность ДНК). Ферментативный синтез — с помощью фермента обратной транс - криптазы (ревертазы) на матрице мРНК синтезируют комплементарную ДНК.

Существенно изменились принципы медико-генетического консультирования: благодаря ДНK-диагностике у неврологов появилась возможность раннего выявления носителей мутантного гена и в ряде случаев проведения превентивной терапии на пресимптоматической стадии болезни. Более того, проведение пренатальной ДНК-диагностики позволяет в настоящее время достоверно оценивать генетический статус плода п при необходимости рекомендовать прерывание беременности, способствуя профилактике повторных случаен заболевания в отягощенных семьях. Новейшей страницей профилактики наследственной неврологической патологии является разработка методов преимплантациопной ДНК-диагностики.