 |
Конструирование геномных библиотек. 2 глава
|
|
|
|
2) Другой подход к «распрямлению» хромосом – это молекулярное причесывание. В основе этого метода – 2 физических явления: способность ДНК сорбироваться на стекле и действие капиллярных сил. В раствор ДНК опускается покровное стекло, обработанное специальным способом, чтобы ДНК сорбировалась лучше. При этом ДНК какой-то своей частью закрепляется на покровном стекле, затем стекло начинает выниматься из раствора с помощью специалього очень медленного мотора. При прохождении стекла через поверхность раствора капиллярное натяжение поверхностной пленки воды распрямляет молекулы ДНК. То есть за счет капиллярных сил ДНК практически выравнивается. ДНК и в этом случае находится в напряженном состоянии. Далее процедура такая же: линейные напряженные препараты ДНК обрабатываются рестриктазой, и места разрыва визуализуются.
Суть методик фореза и оптического картирования одна: увидеть длину фрагментов, полученных при рестрикции. Причем оптическое картирование даже лучше: длина фрагментов измеряется непосредственно, а не опосредованно через подвижности.
Эти методики позволяют построить карты, но привязать к этим картам конкретные маркеры непросто.
Методика флюоресцентной гибридизации на препаратах позволяет непосредственно локализовать на хромосомной карте интересующий Вас локус. Например, хочется выяснить, где на хромосоме расположен ген. Готовится радиоактивная или флуоресцентная проба к гену, ДНК фиксируется на стекле, а затем начинается гибридизация с препаратом ДНК. ДНК окрашивается специальным цитологическим красителем (например, по Гимза), чтобы получить характерную картинку полос. Далее ДНК рассматривается под флуоресцентным микроскопом. На препарате видно, где локализована метка. Значит, можно привязать флуоресцентный сигнал к карте полос на хромосоме. Для модельных объектов (основных организмов) давно построены цитологические карты. Есть характерный рисунок полос в результате обработки каждым из красителей. Цитологические карты – тоже своего рода физические карты хромосом, но тут расстояния не напрямую эквивалентны физическому расстоянию, потому что по-разному упакованы различные участки хромосом.
|
|
|
Проблема методики флюоресцентной гибридизации: низкая разрешающая способность, т.к. характерное цитологическое окрашивание возможно только для компактизированных хромосом. В хроматине есть ДНК и белки, и окрашиваются при взаимодействии с красителем именно белки. То есть используются метафазные хромосомы (компактизированные). Разрешающая способность методики FISH-картирования 1 млн.нукл.пар. Для реального расположения генов на геномной карте нужна б о льшая точность. Большей разрешающей способности можно добиться при модификации этого метода. 1) механическое растягивание хромосом. Например, открутить в центрифуге,правильно выбрав ускорение. Белки при этом не отсоединяются, просто картинка становится чуть более размытой. Это увеличивает разрешающую спосбоность в 3-5 раз. Предел метода - 200 000- 300 000 нуклеотидных пар. Дальнейшая модификация связана с дальнейшим растягиванием хромосом, однако характерная цитологическая окраска утрачивается. Ненадежно. 2) Использование неметафазных (интерфазных) хромосом. Разреш. спос-ть – до 25 000 нукл.пар, но невозможно различить, с чем гибридизовалась метка. Нужно уже две метки, чтобы соотнести их расположение друг относительно друга. Это слишком трудоемко. Модификация методики - Fiber-FISH: фибер-рыба J Неметафазные хромосомы еще более растягиваются при помощи причесывания или растягивания в геле – только с хромосом удаляется белок – до 10 кб разрешающая способность.
|
|
|
Принципиально другой подход в физическом картировании – это STS-кртирование. Д анная методика удобна тем, что одновременно строится физ. карта генома и отбираются клоны для последующего секвенирования. Работа ведется на геномной библиотеке. То есть картируются те самые клоны, на основе которых будет составлена геномная библиотека. Это тоже непрямое картирование. Физическое расстояние между локусами не измеряется. Оно подсчитывается сложными математическими формулами на основании частоты совместного размещения двух маркеров в одном фрагменте ДНК. Если случайным образом фрагментировать геномную ДНК и сделаем библиотеку с определенным размером вставки, например, 50 000 или 100 000 нукл. пар, есть определенная вероятность того, что 2 маркера будут попадать в один фрагмент. Если геном 1 000 000 нукл. пар, а вставки по 100 000, то вероятность нахождения одного маркера в определенном фрагменте равна 1/10. Вероятность того, что 2 маркера вместе будут именно в этом фрагменте, равна произведению вероятностей, то есть 1/100, или 1%.
Чем ближе локализованы маркеры, тем чаще они будут располагаться на одном фрагменте ДНК. Есть формулы, по которым цифры по частоте встречаемости маркеров на одном фрагменте переводятся в единицы, отражающие удаленность маркеров на ДНК. Для такого картирования нужна коллекция маркеров и коллекция фрагментов ДНК. Набор перекрывающихся фрагментов ДНК называется контиги. В простейшем случае это просто одна из геномных библиотек. Маркеры – это STS (Sequence Tagged Site), то есть сайт, который маркирован последовательностью. Это просто короткий фрагмент ДНК с известной нуклеотидной последовательностью. В простейшем случае это могут быть случайные фрагменты генома, которые были клонированы в какие-то векторы и потом секвенированы. Смысл имеет только тот маркер, который является уникальным в геноме. Если последовательность повторена, то в ее использовании как STS не будет никакого смысла. Требования к STS: должна встречаться в геноме 1 раз, нуклеотидный состав должен быть известен. Для STS 100 нукл. пар достаточно, лучше чуть больше. До 500 нуклеотидов. Самый удобный и основной источник – это IS 7 сиквенсы, то есть сиквенсы случайных клонов кДНК. Т.к. подавляющее количество матричных РНК соответствует уникальным генам, то очень вероятно, что случайный фрагмент кДНК удовлетворит требованиям к STS. Небольшая модификация этого подхода: использование в качестве STS полиморфизмов по коротким повторам. Эти полиморфизмы - минисателлиты и микросателлиты. Случайные геномные последовательности тоже можно использовать в качестве таких маркеров, но только в тех геномах, где низкая встречаемость повторов. Например, у бактерий. При использовании этого метода для эукариот нужно предварительно проверять уникальность маркера. Это существенно усложняет процесс.
|
|
|
Принцип STS-картирования СЛАЙД:
Есть хромосома и набор ее фрагментов, многократно перекрывающихся. Многократно перекрываются, чтобы можно было посчитать частоту. Для этото выделяются препараты ДНК из большого количества клонов, а потом ставится ПЦР с парами праймеров, которые подобраны к послед-тям от 100 до 500 нукл. пар. Если сиквенс есть, то можно подобрать пару праймеров, которая будет специфически его амплифицировать. Соответственно при помощи ПЦР можно легко детектировать наличие соответствующей STS-последовательности в геномном фрагменте. Если локусы расположены близко друг к другу, они часто будут попадать на один фрагмент ДНК. То есть чем ближе расположены локусы, тем больше вероятность их расположения на одном фрагменте. Зная среднюю длину фрагментов, можно статистически пересчитать растояние между маркерами и таким образом провести картирование и сразу отобрать клоны, которые будут перекрываться, для последующего секвенирования.
Есть 2 варианта реагентов картирования.
1. Для генома млекопитающих особенно актуален набор клеток радиационных гибридов. Это гибридомы клеток. Одна из слившихся клеточных линий, облучена летальными дозами ионизирующей радиации. Т.е. гамма-излучением, которое вносит двунитевые разрывы в хромосомы. Летальность связана с тем, что фрагментирован геном. Вторая линия не облучена, но дефектна по питательным потребностям. После слияния клеток и помещения их на селективную для необлученной линии среду выживать будут только клетки с комплементирующими участками ДНК из облученных клеток. Это когда клетка из облученной линии сливается с ауксотрофом, мутация которого находится в том же участке, который остался у первой интактным. Далее в клетке происходит целый ряд репарационных процессов. В том числе может происходить транслокация сразу нескольких фрагментов разорванных хромосом, они встроятся в геном необлученной клетки в случайных местах. При правильной постановке эксперимента достаточно получить около ста линий, чтобы был презентативный набор фрагментов. Они будут перекрывать весь геном, соответствующий геному необлученной клетки. Затем, когда у нас есть набор таких гибридом, радиационных гибридов, их можно использовать в качестве реагента картирования и делать все то же самое. С той разницей, что здесь чужеродные фрагменты будут встроены в хромосому другой бактерии. Но если использовать маркеры, которые отсутствовали в геноме необлученной клетки, то будет специфическая ПЦР, и, соответственно фрагменты можно достаточно быстро картировать. Удобство заключается в том, что кажлый клон, если выделять препарат ДНК, содержит достаточно большое количество этих фрагментов. Добавляются свои статистические сложности, но картировать можно, высчитывая вероятность совместного нахождения в одной линии гибридом двух маркеров. С небольшим количеством линий (100) нужно набирать больше статистики, то есть более точно вычислять вероятность совместного наследования. Методика детекции при использовании STS-маркеров была автоматизирована. Есть несколько подходов к модификации. Понятно, что детекция идет за счет ПЦР, которая ставится в планшетном формате, процесс роботизирован. На факультете – прибор для ПЦР в реальном времени, 1 планшета на 96 лунок, есть системы, которые рассчитаны на планшеты с 384 ячейками, а ячейка разбита еще на 4 части. Есть машины, которым можно зарядить сразу пачку этих планшет. 384*5 проб за 12 часов. Нужно после амплификации визуализировать результаты. Как всегда, для этого есть несколько методик J, например, ПЦР в реальном времени. Добавляется еще один зонд, специфический к середине ПЦР-продукта. Обычно если специфический продукт есть, сигнал детектируется. Если нет, то детекции не будет. Здесь немного другой принцип. Если во время ПЦР добавить интеркалирующий краситель, то сигнал будет детектироваться, если реакция идет. Но в этом случае ДНК будет непригодна для дальнейшего использования. Сейчас есть какие-то понтовые красители, которые окрашивают ДНК во время ПЦР и при этом не портят ее. Но это дорогостоящие реагенты. Но этот метод можно использовать только для каждого маркера в отдельности. Чтобы иметь возможность детектировать сразу два маркера в одной пробе, придумали следующее: конструируют зонд ДНК из примерно 20 нуклеотидов, к одному концу которого цепляют флуорофор. К другому – гаситель флуоресценции. На расстоянии в 20 нуклеотидов гаситель еще действует. У полимеразы есть 3прим-5прим экзонуклеазная активность. Когда идет ПЦР, то полимераза, двигаясь по ДНК, вырезает нуклеотиды, и они переходят в раствор. Если полимераза работает, то флуорофор и гаситель перейдут в раствор, причем на отдельных нуклеотидах. Т.е. есть реакция – есть флуоресценция. Причем чем больше продукта, тем сильней будет светиться. Вот это принцип ПЦР в реальном времени. Большинство машин позволяет детектировать сразу несколько таких меток, поскольку флуоресцентные белки есть разные, с разной длиной испускания. Тогда для каждого маркера – свой флуорофор, и можно гнать в одной пробе. Вывод: автоматизация процесса дает очень большой «КПД». Реальность этой методики была показана в 2002 году на проекте расшифровки мышиного генома. За пару месяцев одна лаборатория с хорошим оборудованием может дать бешеные результаты. За полгода было локализовано более 90 000 генов на карте хромосом гибридов. И еще несколько локусов тоже. Ошибок практически не было. СЛАЙД:Одну и ту же клонотеку при использовании STS-картирования либо в той, либо в другой вариации можно использовать и для физического картирования, и для последующего секвенирования, поскольку одновременно отбираются и фигачатся фрагменты генома.
|
|
|
|
|
|
Д ля эукариотических геномов, которые содержат, как правило, много хромосом, еще одна проблема при работе с ними – разделение хромосом. У большей части прокариот просто: одна хромосома. А у эукариот надо выяснить, на какой из хромосом находится фрагмент ДНК. Поэтому всегда стараются сделать отдельные библиотеки для каждой из хромосом. Стандартная методика разделения хромосом – это флюоресцентная их сортировка на приборе под названием FACS (fluorescent assistant cell sort). Это сортировщик клеток, которому помогает флюоресценция. Суть метода: те частицы, которые нужно отсортировать, метятся какой-то флюоресцентной меткой (она одна и та же что для клеток, что для хромосом), т.е. краситель связывается с ДНК. Готовится препарат определенной концентрации, затем препарат помещается в пробирку, из которой медленно капает раствор с препаратом. Одна частица – на одну каплю. Капли проходят мимо луча лазера, по другую строрну от которого - детектор флуоресценции (фотодетектор). Если частица имеется в капле, то будет какая-то флуоресценция, она улавливается, причем количественно. Чем крупней хромосома, тем сильней сигнал от частицы. Очень точное измерение: за время пролета капли машина определяет точно, какая хромосома в ней пролетела. Затем капля летит между двумя электродами. Один заряжает каплю в соответствии с уровнем ее флуоресценции. Еще два электрода создают линейное электрическое поле, в котором капли отклоняются в зависимости от заряда либо влево, либо вправо. И падают то в одну пробирку, то в другую. Таким образом препарат можно в соответствии с зарядом разделить на группы. На таком сортировщике можно разделить все хромосомы человека за исключением одной пары с более-менее одинаковой флюоресценцией. Затем там меняются красители, и эта пара тоже разделяется. После такого разделения можно строить банки хромосом для каждой из них в отдельности.
Как идет сиквенс.
Пиросеквенирование еще не получило широкого распространения. Один прибор стоит от 1,5 млн до млн. $, а один прогон – порядка 80 000 $. Ранней весной 2008 года вышла новая методика секвенирования, совсем другой принцип секвенирования: последовательности этой машины меньше, чем выдает пиросеквенатор. А именно – 26 нуклеотидов. Зато дает огромное количество вот этих последовательностей. Получается гораздо дешевле. Стоимость прибора – 150 000$, а один прогон – 400$. Это второе поколение секвенаторов. Классический подход: по Сэнгеру. Чтобы получить нормальный сиквенс, нужно уделять внимание оптимизации условий. На качкство сиквенса влияет целый ряд факторов. Ключевой – качество матрицы ДНК, его чистота. Остальные компоненты покупаются. Буфер, праймеры, полимераза, нуклеотиды, дидезокситерминаторы. Что-то в реакции должно быть мечено: либо праймеры, либо нуклеотиды. Матрица классически – это плазмидная ДНК, т.к. секвенирование делается в основном на плазмидах. Другие матрицы - фаги и их производные. На самом деле лучшая матрица для секвенирования – геном (одноцепочечная ДНК) нитевидных фагов типа М13. На заре секвенирования, когда много внимания уделялось длине прочитанной последовательности, использовались почти только молекулы на основе одноцепочечных фагов. Точней даже это были фазмиды. Сейчас используются с другими целями. Фазмида какая-то sd4bluescript – это одна из таких. Кроме бактериальной точки репликации несет и фаговую. При необходимости можно получить ДНК этой фазмиды в одноцепочечной форме, но сейчас без надобности. Для этого нужно заразить клетку, несущую этот фаг, хелперным фагом. Процедура «неприятная». Используются на стадии финиширования сиквенирования, когда надо закрыть небольшой пробел. ПЦР-продукты – нормальные матрицы для сиквенирования. Все прокатывает даже у студентов J Два варианта праймеров для сиквенирования: 1) классика – отжиг праймера к последовательности вектора. Стандартный универсальный праймер, подходящий для всех клонов. Это дешевле. На стадии финиширования целесообразно использовать специфические праймеры к конкретной последовательности. Заказывают внутренние праймеры для неотсиквенированного участка. Получается что-то вроде прогулки по хромосоме. Делается сиквенс концов, а потом заказываются праймеры для концевого участка сиквенса. И т.д.. Такой подход оправдан только на стадии завершения. Критичный компонент ПЦР – ДНК-полимераза. Прогресс в качестве сиквенса заключается в модификации полимеразы. Еще Сэнгер использовал первый инструмент – фрагмент ДНК-полимеразы1, фрагмент Кленова. Надежный, но не очень высокая процессивность (постоянно сваливается с матрицы после пары десятков нуклеотидов). Ничего хорошего. На основе полимеразы фага Т7 был сделан более надежный инструмент: в результате нескольких нуклеотидных замен были инактивированы экзонуклеазные активности, фермент получил название сиквеназа. Уже этот фермент работал нормально, более 1000 нукл. пар. У полимераз 2 экзо- и 1 эндонуклеазная активность. 3прим-5прим экзо будет заменять дидезоксинуклеотиды. Экзонуклеазная активность в другом направлении будет подъедать праймеры с 5прим-конца и, возможно, подрезать продукты сиквенирования. Значит, размер этих продуктов будет варьировать. Тогда сиквенс не удастся. Т.к. при координации фрагментов в одной фиксированной точке к них будут немножко разные начала, и в результате четкой полоски при проведении фореза не получить. Эта первичная модификация – требования к базовой сиквеназе. Должна быть процессивной, тогда она будет нечувствительна к элементам вторичной структуры. Еще не должна иметь экзонуклеазных активностей. Была и другая трудность: некоторые области ДНК имеют весьма устойчивую вторичную структуру и могут не прочитаться даже модифицированным ферментом. Самое простое решение этой проблемы – использование термостабильных фрагментов. Реакция проводится при более высокой температуре, и вторичная структура денатурирует. Сейчас юольшинство используемых ферментов делается на основе Taq-полимеразы или чего-нибудь очень похожего. Названия у нее разные. Много модифицированной Taq-полимеразы выпускается. Еще сикввеназа модифицируется с целью повышения сродства к терминаторным нуклеотидам. Преимущество термостабильных полимераз – реакцию можно гнать циклически. Даже линейная циклическая реакция позволяет прогнать ее несколько раз. В результате раз в 30 больше продукта на одном и том же количестве матрицы.
Конкретные методики сиквенирования различаются по целому ряду параметров. По типу реакции: циклическая и изотермическая. Фрагмент Кленова и стандартная сиквеназа – изотермическое сиквенирование, а циклическое – термически стабильная, почти всегда предпочтительней. По способу включения метки: 1) праймеры, меченные терминатором,? самое первое – это включение метки в начале реакции. Стандартная методика с сиквеназой включала добавление радиоактивно меченного аденозинтрифосфата в начале реакции, первая фаза реакции, 5 минут при комнатной температуре, шла с бедной нуклеотидной смесью и без терминаторов. Добавлялся меченный нуклеотид. Сиквеназа добавляла пару десятков нуклеотидов, включая меченный, причем неоднократно. Чем больше меченных нуклеотидов было в цепи, тем сильней был сигнал. Потом добавлялись уже терминальные смеси при оптимальной температуре, при 37 градусах. Меченные праймеры - самый дешевый вариант. Один набор надооолго. Собрать смесь можно при наличии рагентов самостоятельно специально для опыта. Качество сиквенса при этом варьирует. Преимущества меченных терминаторов (они дороже): мечены только те продукты, в которых реакция прошла до конца, и если терминация прошла преждевременно, то такой продукт будет немеченным. И его невозможно будет зафиксировать. Т.е. сиквенс получается более высокого качества. Каждый из терминирующих нуклеотидов можно пометить своей собственной флюоресцентной меткой. Тогда можно все 4 реакции проводить в одной пробирке, детектируя место терминации при помощи специальной оптики: лазер с разной длиной волны возбуждения, флюорофор с разной длиной испускания света и соответственный сиквенатор. Сейчас используются сиквенаторы производства BlySistems, они как раз для таких штук. Метки радиоактивные и флуоресцентные. Сейчас – почти всегда флуоресцентные. Автоматизация при этом легче. Сейчас сиквенаторы автоматические.
СЛАЙД картинка сиквенса. На выходе имеем хроматограмму (электрофорез – как вариант хроматограммы), где каждый пик соответствует прохожлению определенного фрагмента мимо детекторов. Сбоку это все облучается лазером, и регистрируется пик. Пики– с разных детекторов. На этом же слайде: проблемы ближе к 1000 нуклеотидов. ограничение – 600-700 нуклеотидов.
Лекция 5.
Шотган подход, преимущества:
Действительно просто (думать не надо) порезал ДНК, засунул в секвенатор и уже на выходе готов сиквенс, затем при помощи компьютера эти кусочки собираются. В связи с тем, что это всё автоматизировано, получается быстро, а так как затраты ручного труда малы, это получается ещё и дешево. Используется активно.
Недостаток – качество неважное. Проблемы:
Особая сложность при попытки секвенир эукариот, очень много повторов – минисаттелиты, транспозонные последовательности. Если используется шотган подход, те случайное секвенирование, а потом автоматическая сборка полученных фрагментов ДНК легко получить совершенно неправильную сборку последовательности
Есть два типа повторов которые создают проблемы
Сначала тандемный повтор (таких повторов очень много) минисаттелиты, многие локусы генов (гемоглобиновые гены человека) кластер генов, которые друг за другом повторяются Если повторы идентичны автоматическая сборка без учета дополнительных факторов всегда оставит только один из тандемных повторов, тк сиквенс-то идентичный. Если четко получается накрывается место стыковки, то тогда поскольку будет видно, что конец одного повтора переходит в начало следующего, то останется два повтора, но а если их было десять, то всё равно останется два. Так как автоматически, если посмотреть как можно состыковать эти фрагменты, то всё равно всё количество фрагментов сводится к двум.
Если повторы не тандемные, а разбросанные по геному. Если расстояние между ними невелико очень велика вероятность того, что в каком-то месте сиквенса не будет, эти кусочки между собой не будут стыковаться, а если между ними есть ещё какой-то пробел, то при автоматической сборке в последовательности вместо двух повторов будет один а фрагмент будет отсутствовать в геноме, это гораздо более существенная ошибка с точки зрения информации, которую мы теряем. В первом случае мы теряем только число повторов, но по крайней мере знаем, что они есть и в идеале можем знать, что их там несколько. Во втором же случае остаётся только один фрагмент и будет утрачен кусок нуклеотидной последовательности между ними, это очень серьёзная ошибка, которая связана с шотган-подходом. Вентеровские сиквенсы первоначально содержали много таких неточностей. Чтобы предотвратить такие ошибки в данном случае помогает только повторная физическая карта генома, так как по маркерам будет видно, какой размер участка с повторами, даже если вы точно до нуклеотида не определите, то по крайней мере будете приблизительно знать, сколько там таких повторов в соответствующем участке ДНК может поместиться, если было проведено точное картирование, то вплоть до нуклеотида можно определить. Вы знаете, что повторы здесь, знаете расстояние между ними, если ката подробная, то просто посчитать сколько там повторов, чтобы получить точную информацию.
Решение второй проблемы: для того, чтобы повысить гарантия того, что мы не утратим уникальную последовательность, нужно иметь клонотеку, в которой размер вставки вектора будет превышать максимальный размер повтора, как правило это несложно, потому что обычно повторы имеют размер до десяти тысяч нуклеотидных пар, то есть делается библиотека клонов размеров от десяти до двенадцати тысяч пар и нормально получается. Тогда, когда такая библиотека есть делается секвенирование концов таких среднего размера вставок и внимательно смотрится, куда попадают концы повторов.
Например у нас есть один конец вставки попадает в уникальную последовательность, а другого конца вставки нету, то есть это такой случай, когда у нас было два повтора, и утратилась уникальная последовательность между ними, если она утрачена, то один из концов «повиснет в воздухе». При нормальной сборке оба фрагмента сиквенса будут присутствовать в геноме, при неправильной сборке один из концов будет отсутствовать.
Или другой вариант, если вы точно знаете если один конец попадает в геномный повтор, то второй конец с высокой долей вероятности должен попадать в уникальную последовательность и это помогает точно привязать. Каждый из этих повторов они в принципе одинаковы, библиотека позволяет точно закрепить повтор в нужном месте нуклеотидной последовательности. Если допустим у вас есть сиквенс, один конец которого в повтор попадает, другой тоже где-то болтается, то значит произошла неправильная сборка, ошибка при стыковке фрагментов между собой.
В связи с тем, что возникают такого рода сложности стандартной простой бактериальный шотган-подход был модифицирован и главная модификация состоит в том, что должно быть как минимум две библиотеки в векторах раличного типа. Размер вставкидолжен превышать размер повтора, потом выяснилось, что на самом деле нужно иметь три библиотеки - один в pUC, второй со вставками в низкокопийном векторе, чтоб не было проблем с токсичностью, и вставки 10-12, максимум 14 тысяч нуклеотидов, третьи BAC (bacterial artiphicial chromosomes). То есть мы имеем три типа библиотек – в pUC, средний размер вставки и крупный размер вставки. То есть библиотеки используются не только для картирования, для получения перекрывающихся клонов, концы BAC тоже всегда секвенируются, это непростая процедура, так как очень сложно выделить ДНК бактериальный искусственных хромосом, она не очень хорошего качества, следовательно и сиквенс получается не очень точный, но всё же секвенируются концы и эта информация также даёт «дальнобойную привязку» коротеньких фрагментов к друг другу. Всегда на выходе шотган-подхода получаются какие-то фрагменты сиквенс BAC позволяет их расположить правильно, выяснить, что за чем идёт, можно досеквенировать, то есть это очень важная информация, которая всегда используется.
Как в целом происходит сборка фрагментов сиквенса? Есть несколько подходов, самый простой из них это так называемая прогулка по хромосоме. Это экспериментальный подход может реализовываться по-разному. Можно при помощи гибридизации, можно при помощи ПЦР. Суть сводится к тому, чтобы находить какие-то фрагменты ДНК, которые между различными клонами являются общими, таким путём можно накрыть пробел, и фрагмент уже известного сиквенса расположить упорядоченно. Два момента, в которых возникает проблема стыковки различных фрагментов. В целом и сборка фрагментов сиквенса и во-вторых ещё и поиск недостающих фрагментов, когда нужно оставшиеся проблемы в геноме закрывать, как правило в современных геномных проектах эта стадия встаёт уже на стадии финиширования, то есть когда нужно пробелы закрыть, действительно таким образом чаще всего отбираются недостающие клоны из библиотеки, то есть стыкуются уже секвенированные кусочки друг с другом. Помимо ПЦР есть ещё достаточно удобный подход, который в частности использовался в проекте «Геном человека», когда вместо ПЦР делалась очень подробная и качественная рестрикционная паспортизация клонов. Что это такое? Стандартные BAC-клоны резались обычными рестриктазами (в геноме человека основная рестриктаза – Hind III) фрагментов на 20-30, если прогнать очень хороший качественный агарозный гель-электрофорез, были потрачены некоторые усилия на оптимизацию этой методики, получается очень чёткая картинка полос, можно определить их молекулярную массу достаточно хорошо, каждый клон BAC-библиотеки человеческого генома имел такой паспорт, кроме Hind III использовалась ещё одна рестриктаза, и поскольку качество этой рестрикции было достаточно высоким, просто сравнивая различные BAC-клоны между собой, можно было отобрать такие клоны, в которых есть общие фрагменты. Достаточно простая ситуация, если есть несколько общих фрагментов, то с очень высокой степенью вероятности, можно говорить о том, что соответствующие BAC имеют перекрывающиеся фрагменты. Помимо ПЦР, которая действительно однозначный ответ даёт, можно использвать ещё и простую рестрикцию. ПЦР удобна тем, что небольшая модификация позволяет упростить поиск нужного клона. На слайде схема комбинаторного скрининга, суть в том, что ПЦР-методика чувствительная и если у вас какая-то смесь матриц, но нужная матрица есть, вы всё равно получите сигнал. Вместо того, чтобы гнать ПЦР с каждым из подозреваемых BAC-клонов, которые нужно проверить на наличие исходного фрагмента, можно смешивать в одной пробирке несколько матриц и если делать это в планшетном варианте, можно задать роботу программу, он сам смешает матрицы, если идёт выделение ДНК в планшетном формате можно тому же роботу дать задание смешивать матрицы в произвольном порядке, суть сводится к тому, что берём в планшетке смешиваем все образцы одного ряда у нас получается в результате 8 пробирок со смесью матриц, в каждой из которых 12 матриц, и вертикальные ряды тоже, здесь получается по 8 матриц, получаем 20 смесей матриц и вместо 96 уникальных ПЦР мы прогоняем всего лишь 20, в пять раз уменьшается количество ПЦР. Если задачей является просто найти один единственный нужный клон, если он найден, то потом просто погоняютя индивидуальный ПЦР с матрицами, которые находились в той пробирке, где был обнаружен сигнал. Таким образом экономится время, количество ПЦР, которые нужно провести, то есть максимум ПЦр, которые нужно будет прогнать это 20 и 12. На ещё одном слайдк показан более сложный вариант, когда берётся стопка планшеток и смешиваются образцы ещё и вертикальном направление, то есть ячейка А1 берётся из каждой планшетки, то есть если 10 планшеток, получается 20 таких образцов. 8 таких и 96 таких.
|
|
|
