Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Пространственная организация синтеза мРНК




Внутриядерный синтез мРНК и доставка зрелых транскриптов к месту их трансляции требуют участия множества тонко сбалансированных во времени, пространственно организованных молекулярных механизмов. Выше уже были рассмотрены основные молекулярные процессы, обеспечивающие сборку инициационных и элонгирующих нуклеопротеиновых комплексов, а также механизмы котранскрипционных и посттранскрипционных модификаций РНК, включая кэпирование, сплайсинг, редактирование их первичной структуры и полиаденилирование. Теперь кратко суммируем известные факты о внутриядерной компартментализации этих процессов.

Аппарат транскрипции, участвующий в синтезе пре-мРНК, ассоциирован с перихроматиновыми фибриллами, обнаруживаемыми на границах доменов конденсированного хроматина. Эти фибриллы представляют собой ядерные рибонуклеопротеиновые комплексы диаметром 3–20 нм. Они включают в себя растущие цепи пре-мРНК, и плотность фибрилл коррелирует с транскрипционной активностью соответствующих участков хроматина. С помощью иммунохимических методов здесь же обнаружены компоненты аппарата сплайсинга, который удаляет интроны из предшественников мРНК одновременно с элонгацией транскриптов.

В опытах по внутриядерной локализации мест синтеза специфических транскриптов с использованием импульсной радиоактивной или флуоресцентной меток такие РНК были обнаружены в виде "треков" или более компактных "точек" в одном или двух дискретных участках ядра, что соответствует копиям соответствующих генов на гомологичных хромосомах. При этом с использованием одновременной гибридизации ДНК и РНК было показано, что транскрибируемые гены расположены прямо в треках или точках на одном из концов трека. Более того, зонды, специфичные в отношении последовательностей интронов, метят треки только вблизи гена, указывая на то, что сплайсинг происходит вдоль этого следа РНК.

Треки РНК тесно ассоциированы с дискретными внутриядерными структурами, называемыми межхроматиновыми гранулами, или спеклами. Спеклы обогащены компонентами аппарата сплайсинга, а также содержат интронсодержащие пре-мРНК и полиаденилированные молекулы. В соответствии с этим спеклы могут представлять собой места процессинга пре-мРНК и аккумуляции зрелых мРНК внутри ядер. В ряде случаев выявляется неслучайная ассоциация активно транскрибируемых генов со спеклами, которые могут маркировать внутриядерные области транскрипции. Противоречивость этой интерпретации заключается в том, что в ядре обнаруживаются одновременно всего 20–50 спеклов, тогда как транскрибирующихся генов значительно больше. Следовательно, не каждый транскрибируемый ген ассоциирован с такими структурами. Большинство экспериментальных доказательств ассоциации мест транскрипции со спеклами получено для особо активных генов, например гена коллагена, транскрипты которого в фибробластах составляют до 4% суммарной РНК. Возможно, спеклы представляют собой микрокомпартменты, в которых происходит процессинг РНК наиболее активно транскрибируемых генов.

После завершения синтеза и объединения с компонентами аппарата сплайсинга, формирующими сплайсомы, пре-мРНК переносится к ядерной оболочке и выходит в цитоплазму. Выход РНК из ядра в цитоплазму осуществляется через поры в ядерной оболочке, входящие в состав ядерного порового комплекса (NPC). NPC является постоянно существующим микрокомпартментом, однозначно идентифицируемым с помощью микроскопических, генетических и биохимических методов.

Во время внутриядерного транспорта молекулы РНК объединяются с другими белками, участвующими в их процессинге, образуя гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиновые комплексы (гяРНП), в которых пространственная структура пре-мРНК оптимизирована для ее созревания. Ядерный матрикс, получаемый в результате удаления из ядер большей части хроматина, все еще содержит пре-мРНК, гяРНП и некоторые компоненты аппарата сплайсинга. Это может указывать на внутриядерную избыточность гяРНП и их роль в формировании пространственной структуры ядер. В общем, для гяРНП характерно диффузное распределение в нуклеоплазме, однако часть из них может концентрироваться в окрестностях спеклов и даже следовать за РНК из ядра в цитоплазму и вновь возвращаться в ядра вместе с транскриптами.

Процесс перемещения специфических пре-мРНК от генов в цитоплазму клеток был подробно исследован в случае экспорта частиц пре-мРНП колец Бальбиани комара Chironomus tentans, экспрессирующиеся гены которых находятся в составе гигантских пуффов политенных хромосом слюнных желез. Крупные транскрипты этих пуффов во время элонгации упаковываются в гяРНП в виде тонких фибрилл, которые по мере удлинения пре-мРНК становятся толще и изгибаются с образованием кольцеобразных структур. Зрелые гранулы пре-мРНП, которые, как полагают, заключают в себе РНК, претерпевшую сплайсинг, движутся в нуклеоплазме к ядерной оболочке, где задерживаются вблизи ядерных пор. В это время они приобретают форму палочек, которые проходят через ядерные поры, начиная с 5’-конца заключенной в них РНК. Как только пре-мРНК появляются на поверхности цитоплазматической части ядерной мембраны, они объединяются с рибосомами. Следует подчеркнуть, что на протяжении всей этой цепи событий РНК находится в составе пространственно упорядоченных РНП-частиц. Накапливаются данные в пользу того, что перемещение РНК от гена к ядерной мембране не является следствием простой диффузии. Такому простому объяснению, в частности противоречат факты тесной ассоциации транскриптов, гяРНП и компонентов аппарата сплайсинга с ядерным матриксом. В ряде случаев находит подтверждение гипотеза ядерной фиксации генов (gene gating model), предложенная Г. Блобелом (1985 г.), в соответствии с которой конкретные гены функционально связаны с определенными участками (и порами) ядерной мембраны, что направляет их транскрипты для экспорта в цитоплазму к этим конкретным участкам. Однако такое правило подтверждается не всегда. В частности, РНК коллагена обнаруживают распределенной вдоль всей ядерной мембраны, что указывает на ее выход в цитоплазму через многие ядерные поры.

Для рассмотренных выше структур, образование которых сопровождает синтез, процессинг и экспорт РНК из ядра в цитоплазму, характерен динамизм – отдельные их компоненты могут перемещаться между микрокомпартментами. Синтез, процессинг и транспорт РНК в ядре происходят в составе дискретных компартментов нуклеоплазмы, что позволяет концентрировать регуляторные, структурные и ферментативные компоненты транскрипции и сплайсинга в местах активно экспрессирующихся генов. Действительно, все этапы сплайсинга можно воспроизвести в разбавленных растворах in vitro при концентрации белка ~1 мкг/мл. Однако скорость этих реакций в таких системах значительно ниже наблюдаемой in vivo, где внутриядерная концентрация РНП превышает 50 мг/мл. Кроме того, пространственно упорядоченная организация ранних этапов экспрессии генов создает необходимые условия и дополнительные уникальные возможности для ее регуляции, что было бы невозможно в случае свободной диффузии компонентов этой системы.

Ядерные тельца и домены

Исследования структурно-функцональных отношений в ядре в связи с компартментализацией транскрипции, процессинга РНК и репликации продемонстрировали наличие особых функций у многих морфологически различимых внутриядерных микроструктур. В этом отношении не явились исключением и ядерные тельца, вначале описанные чисто морфологически.

Свернутые тельца (coiled bodies). Эти внутриядерные ультраструктуры, обнаруживаемые в виде клубка переплетенных нитей в ядрах клеток млекопитающих, часто ассоциированы с периферией ядрышка. В составе этой ультраструктуры обнаружены белки и РНК ядрышка, участвующие в модификации и процессинге рРНК, включая фибрилларин и малые ядрышковые РНК U3. В этих структурах также обнаруживают малые ядерные РНП, в частности U7-мяРНП, и некоторые специализированные белки (например койлин p80). Все это указывает на возможное участие свернутых телец в процессинге РНК. Для данных ультраструктур характерен динамизм: они исчезают в митозе и вновь возникают в фазе G1 клеточного цикла. Их количество резко возрастает в условиях стимуляции пролиферации клеток.

Аналогами свернутых телец являются снурпосомы С ядер ооцитов амфибий. Эти тельца ассоциированы с локусом гистоновых генов хромосом типа ламповых щеток и обогащены U7-мяРНК, которая вовлечена в модификацию 3’-концов гистоновых пре-мРНК. Высказывается предположение, что и снурпосомы, и свернутые тельца могут участвовать в посттранскрипционных модификациях гистоновых и других пре-мРНК.

Ядерные тельца PML. Острая промиелоцитарная лейкемия (PML) часто ассоциирована с транслокацией t(15;17) (перенос участка хромосомы 15 на хромосому 17), которая приводит к слиянию в одной рамке считывания гена PML с геном a-рецептора ретиноевой кислоты. У нормальных индивидуумов белок PML, обладающий Zn2+-связывающим доменом типа "пальцы RING", локализован в отдельном ядерном микрокомпартменте в виде плотного фибриллярного кольца, окружающего сердцевину. Этот белок обнаруживают также вместе с U1-мяРНК и койлином р80 в особых зонах, окружающих межхроматиновые гранулы, или спеклы. Ядерные тельца PML претерпевают морфологические изменения на протяжении клеточного цикла. Эти тельца разрушаются во время вирусной инфекции, а для репликации аденовирусной ДНК их разрушение является необходимым этапом, что подчеркивает возможное участие телец в обеспечении антивирусной активности клеток. Инкубация клеток с интерфероном индуцирует синтез PML-белка и подавляет размножение вирусов.

У пациентов с промиелоцитарной лейкемией, содержащих вышеупомянутый гибридный ген, имеет место разрушение ядерных телец PML. Инкубация лейкозных клеток с ретиноевой кислотой приводит к восстановлению этих морфологических структур, что коррелирует с наступлением ремиссии у больных острой промиелоцитарной лейкемией. Предполагается, что тельца PML дикого типа участвуют в подавлении неконтролируемого роста трансформированных клеток и понижают уровень их злокачественности по непонятному пока механизму.

Ядерные домены WT1. Ген WT1 человека является геном-супрессором опухолей, мутационные нарушения которого наблюдают при злокачественных новообразованиях Вилмса, возникающих в почках в детском возрасте. четыре белка, кодируемые этим геном, возникают в результате альтернативного сплайсинга, и, по крайней мере, один из них является фактором транскрипции. Для полноразмерного белка характерно наличие С-концевого мотива типа "цинковых пальцев" (см. раздел 2.2.2) и N-концевого домена, обогащенного Pro/Gln. Белок WT1 обладает способностью связываться со специфической GC-богатой последовательностью нуклеотидов и подавлять транскрипцию генов, промоторы которых содержат эту последовательность. Для него характерна дискретная внутриядерная локализация в составе морфологически различаемых телец. Ассоциация изоформ WT1 с аппаратом сплайсинга предполагает, помимо прямого влияния на транскрипцию, их участие в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов.

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...