Глава 1. Применение серологических реакций для диагностики инфекционных болезней и идентификации микроорганизмов

Иммунологические реакции in vitro (в пробирке) используют в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний и иммунологических исследованиях. Метод диагностики инфекционных заболеваний, основанный на определении специфических антител в сыворотке крови, называется серологическим.

Серологические реакции применяют в двух направлениях:

• Выявление с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого при наличии набора известных антигенов. В качестве антигенов применяют взвеси микроорганизмов, инактивированные химическими или физическими методами, или используют диагностикумы, представляющие фракции микроорганизма. Как правило, результаты серологической диагностики получают при исследовании парных сывороток крови больных, взятых в первые дни болезни и через определенные промежутки времени от начала заболевания.

• Определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизма или его антигенов с известными иммунными сыворотками. Иммунные сыворотки должны содержать антитела в высоком титре и быть строго специфичными. В лабораторной практике применяют серологические реакции, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация) и опосредованные реакции (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента), а также реакции с использованием меченых антител или антигенов (иммуноферментный, радиоиммунный анализ, метод флуоресцирующих антител).

Процесс взаимодействия антигена с антителом протекает в две фазы.

Специфическая фаза — это взаимодействие, при котором происходит комплементарное соединение активных центров антител и антигенов. Процесс длится от нескольких секунд до нескольких минут. Специфической фаза названа потому, что с антигеном, попавшим в организм, может соединиться только подходящее к нему (комплементарное) антитело.

Неспецифическая фаза — это проявление внешних признаков образования иммунных комплексов (помутнение, выпадение осадка и так далее). Длится от нескольких минут до нескольких часов.

Внешние проявления реакции антитело-антиген зависят от многих факторов: от физико-химических свойств антигена (размеры, физическое состояние), от класса и вида антител, от условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, pH, температура). Поливалентность (способность образовывать больше двух связей) антител и антигенов обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это можно объяснить тем, что к образовавшемуся комплексу антиген-антитело могут присоединяться другие молекулы антител и антигенов на свободные активные центры. В результате формируются довольно крупные агрегаты, которые могут выпасть в осадок.

Еще одной особенностью является то, что наиболее интенсивно реакции антиген-антитело проявляются, если компоненты находятся в эквивалентных соотношениях, то есть лишних антител и антигенов после реагирования не остается.

Иммунологические реакции благодаря высокой специфичности и чувствительности применяют для выявления и количественного определения антигенов и антител. Для выявления неизвестного антигена используют диагностические иммунные антисыворотки. Их получают путем многократной иммунизации лабораторных животных известным антигеном. Обнаружение антител проводят с использованием известных антигенов, которые представляют собой взвесь убитых микроорганизмов, инактивированных высокой температурой, химическими веществами, ультразвуком, рентгеновскими лучами или ультрафиолетовым облучением.

Реакция агглютинации

Реакции агглютинации — это реакции склеивания корпускулярных антигенов (микробы, эритроциты и т.д.) специфическими антителами. Образовавшийся при этом комплекс выпадает в осадок. Эти реакции проводят для определения наличия определенных антигенов или антител. На стекле к капле сыворотки добавляется взвесь бактерий, выделенных из организма или трупа.

Если капля мутнеет, значит, агглютинация произошла и в организме присутствует тот антиген, к которому были антитела (известные) в исходной сыворотке. Также эту реакцию проводят в пробирке: в несколько пробирок наливают исследуемую сыворотку крови с неизвестными антителами, потом к этим образцам добавляют известные диагностикумы (убитые бактерии) и наблюдают, в какой пробирке произойдет помутнение или выпадет осадок.

Реакция агглютинации — взаимодействие антител с антигенами — является двухфазной: в первой фазе происходит специфическое связывание антигена и антитела, во второй — осаждение образовавшегося агрегата, являющегося гидрофобным, солями. Основываясь на этом представлении, принято разделять агглютинины на полные и неполные. Неполные антитела — агглютинины, которые в среде физиологического раствора NaCl не могут осаждать клетки или частицы, даже если они связываются с ними. Классификация агглютининов, основанная на методах их выявления:

• полные агглютинины;

• неполные агглютинины:

– блокирующие антитела, определяемые в тесте блокирования,

– агглютиноиды, определяемые в среде сыворотки, плазмы, альбумина,

– неполные антитела, выявляемые с помощью антиглобулиновой реакции — Coombs,

– криптагглютиноиды, выявляемые после предварительной обработки эритроцитов ферментами,

– агглоиды, обнаруживаемые с помощью коллоидных посредников (поливинилпирролидон, желатина, декстран и др.).

Полные и неполные агглютинины находятся в основном в γ-глобулиновой фракции сыворотки крови. В процессе иммунизации вначале появляются полные антитела, в случае продолжающейся сенсибилизации появляются антитела, способные вызвать агглютинацию лишь при определенных условиях.

Полные и неполные антитела имеют отличительные признаки по физико-химическим свойствам и серологической характеристике. Так, неполные антитела более термостабильны по сравнению с полными, в то время полные менее устойчивы и снижают свою активность даже при хранении в замороженном состоянии. Полные антитела имеют большую авидность к соответствующим антигенам, чем неполные антитела.