Рост и субкультивирование гибридом

Гибридные клетки, растущие в ГАТ, через 7–12 дней формируют в лунках микроскопически различимые колонии. Количество их в планшетах может быть различным, что зависит от посадочной концентрации клеток, эффективности гибридизации.

Первые 5–7 дней среду в планшетах не меняют. В дальнейшем 2-3 раза в неделю производят замену 1/2–1/3 части культуральной среды на свежую ГАТ-среду с 20 % ФСТ. Большинство колоний гибридных клеток хорошо растут, активно истощают среду и требуют более частой ее смены, чем плохо растущие колонии. Культуры с плохим ростом требуют более осторожного обращения, беспокоить их необходимо как можно меньше и добавлять только 2-3 капли свежей среды в неделю.

Скрининг. На 14–21-й день, когда большинство колоний начнут активно расти (о чем судят по быстрому закислению среды культивирования), необходимо проводить тестирование гибридомных супернатантов на присутствие антител. Общепринятым методом скринирования гибридомных культур на специфическую активность является непрямой вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Метод лишен многих недостатков, характерных для тестов вирусной нейтрализации, иммунодиффузии, РСК, РЗГА, ИМФА и др., поскольку основан на обнаружении просто специфического взаимодействия антител с антигеном, а не на выявлении последующего взаимодействия. Так как некоторые гибридомы продуцируют низкие титры антител при культивировании в среде с пониженным содержанием сыворотки, необходимо первые две недели использовать среду, содержащую 20 % ФСТ.

После тестирования отмечают те лунки пластин, культуральная среда в которых содержала антитела к антигенам вируса. Большинство положительно реагирующих лунок будут содержать гибридные клетки. Присутствие антител в культуральной жидкости небольшой части прореагировавших лунок, не содержащих гибридных клонов, объясняется наличием в них фрагментов селезенки, в которых антителопродуцирующие спленоциты некоторое время сохраняют свою жизнеспособность, поэтому через 5–6 дней проводят повторное тестирование. Обычно за это время спленоциты погибают и положительная реакция отмечается лишь в лунках с антителопродуцирующими гибридами.

После тестирования проводят субкультивирование клонов из положительно прореагировавших лунок. Для субкультивирования используют 96-луночные культуральные планшеты с 1–2-дневными культурами перитонеальных макрофагов. В каждую лунку переносят по одному клону из положительных лунок исходных планшет. Через 3–5 дней культивирования пересаженных клонов их жизнеспособность проверяют в инвертированном микроскопе и вновь тестируют гибридомные супернатанты на присутствие антител. Так как неклонированные гибридомы часто теряют способность продуцировать антитела, их необходимо как можно раньше клонировать.

После клонирования гибридомы наращивают для замораживания, а также для получения содержащей моноклональные антитела культуральной жидкости. Для этого клоны с наиболее интенсивной продукцией выращиваются в лунках 96-луночной планшетах до образования почти сплошного монослоя, после чего каждый клон переносится в отдельную лунку 24-луночной пластины с фидерными клетками. К этому времени среду ГАТ заменяют на ГТ, не содержащей аминоптерина. Через 2-3 дня, когда эти культуры подрастут и покроют около 70% поверхности роста, их делят в две другие группы и т.д., наращивая каждый клон до необходимого количества клеток. Культуры гибридом, находящиеся в стадии логарифмического роста, криоконсервируют. Часть клеток, оставшихся после криоконсервации клонов, вновь интенсивно выращивают в ГС, содержащей 20 % ФСТ, до образования сплошного монослоя. Для получения моноклональных антител с целью предварительного исследования их характеристик среду в лунках не меняют 4–5 дней. Когда среда пожелтеет, но клетки еще сохраняют жизнеспособность, ее отбирают, центрифугируют и хранят в стерильных флаконах при –4 °C. При необходимости культуральную жидкость замораживают и хранят при –70 °C.

Для получения моноклональных антител в высоких концентрациях гибридомы вводят в брюшную полость обработанных пристаном мышам линии BALB/c с целью индукции асцитных опухолей.

Если в контрольной ампуле криоконсервированных после восстановления 70–90 % клеток останутся жизнеспособными и не утратят способности секретировать антитела, дальнейшее культивирование гибридомной культуры прекращают.

Клонирование гибридом

Гибридомы, как правило, не являются стабильными клеточными линиями и имеют тенденцию к потере хромосом, что часто приводит к потере антителопродукции. Клетки, потерявшие способность секретировать антитела, приобретают способность к более активному росту и могут перерастать медленно растущие клетки, сохранившие продукцию антител. Обычно уровень антител в культуральной жидкости в это время еще достаточно высок и хорошо улавливается в ELISA. Это может привести к безвозвратной потере многих полезных клонов. Для предотвращения подобных потерь предпринимают как можно более раннее клонирование гибридом, выделяя из смеси продуцирующих и непродуцирующих клеток те, которые сохранили продукцию антител. Клонирование необходимо проводить сразу же после того, как установлена специфичность секретируемых гибридомой антител к вирусу. Для получения достаточно стабильной линии гибридных клеток требуется 2-3 (иногда больше) клонирования. Для поддержания стабильности линии на достаточно высоком уровне необходимо в дальнейшем проводить клонирование не реже одного раза в три месяца при длительном пассировании в культуре, после пассирования на мышах и при больших сроках хранения клонов в криоконсервированном состоянии.

Наиболее распространенным методом клонирования является клонирование в полужидком агаре.

Методика

1. За 2–3 дня до клонирования в одном или нескольких 12-луночных планшетах готовят культуры перитонеальных макрофагов мышей. В каждую лунку пластины вносят по 0,5 мл ГС с 20 % ФСТ, содержащей 10⁴ клеток перитонеального экссудата в 1 мл.

2. За день до клонирования необходимо заменить половину среды в культуре свежей ГС с 20 % ФСТ. В день клонирования на водяной бане разогревают 3%-ный агар Дифко. Расплавленный агар охлаждают до 42 °C. Из лунок пластин с культурами макрофагов отбирают кондиционированную среду и смешивают с равным объемом свежей ГС, содержащей 20 % ФСТ и подогретой до 42 °C. По 10 мл этой смеси вносят во флаконы с расплавленным агаром. Приготовленный 0,5%-ный агар (половину) распределяют по лункам пластин. После застывания агара вносят по 9-10 капель ГС с 20 % ФСТ и в ней суспендируют 20–40 гибридных клеток того клона, который необходимо клонировать. Затем осторожными круговыми движениями пластины перемешивают среду над агаром и добавляют к ней равный объем жидкого 0,5%-ного агара из водяной бани. После повторного легкого взбалтывания ее помещают в холодильник (+4 °C) на 2-3 мин, а затем в СО₂-инкубатор.

3. Активный рост клонов в агаре начинается на 3–4-й день. Когда клоны достигают нужных размеров, их пересаживают из агара в 96-луночные планшеты с 1–2-суточными культурами макрофагов. Желательно в каждую лунку добавить по 50 мкл кондиционированной среды. Пластины с пересаженными клонами инкубируют в СО₂-инкубаторе в течение 2–3 дней. Затем проводят подкормку клеток, внося в каждую лунку с растущими клонами по 50 мкл свежей ГС с 20 % ФСТ. На 5–7-й день клоны тестируют на продукцию ими антител. Их наращивают и замораживают.