 |
Каким образом в эукариотических клетках происходит синтез малых РНК? Каким образом эти РНК участвуют в регуляции активности генов?
|
|
|
|
Малые РНК включают в себя несколько типов олигонуклеотидных РНК-молекул с разными функциями. Их общее свойство в том, что они не кодируют белки.
К ним относят snRNA (малые ядерные – участвуют в сплайсинге), snoRNA (малые ядрышковые – участвуют в модификации рРНК), scaRNA (малые РНК телец Кахаля – направляют модификации snoRNA), miRNA (микроРНК – регулируют экспрессию генов), siRNA (малые интерферирующие – направляют РНК-интерференцию), tRNA (транспортная функция).
Большинство этих малых РНК синтезируются с участием РНК-полимеразы 2 типа (как и мРНК), а значит, могут иметь в своем составе такой компонент как 5’-кэп. Исключение – тРНК и некоторые snRNA синтезируются с участием РНК-полимеразы 3 типа, и такие транскрипты не имеют в своем составе кэп-структуру. Кроме этого, первичные транскрипты тРНК несут интроны и подлежат сплайсингу, причем не классическому, а по механизму вырезания-вставки.
Два типа малых РНК ответственны за регуляцию экспрессии генов, кодирующих белки – микроРНК и siРНК. Образование микроРНК происходит двумя путями: транскрипция генов микроРНК и сплайсинг генов, кодирующих белки, так как много генов микроРНК находится в интронах (!). В первом случае РНК-полимераза 2 типа создает транскрипт первичной микроРНК (причем есть и кэп, и полиА-хвост) или pri-miRNA*, который с участием белка Drosha (у беспозвоночных - Pasha), распознающим двухцепочечные РНК-шпильки, процессируется в пре-микроРНК (предшественник). Некоторые пре-микроРНК подлежат РНК-редактированию.
Далее этот предшественник покидает ядро. Там он процессируется эндорибонуклеазой Dicer и теряет свою шпилечную структуру. Зрелая микроРНК связывается с белком Argonaute, формируя RISC – RNA-induced silencing complex. Теперь, благодаря наличию микроРНК, этот комплекс может найти комплементарный участок в 3’-НТО мРНК и повлиять на судьбу этой молекулы. Если соответствие полное – RISC вызывает деградацию этот мРНК (например, за счет ее транслокации в Р-тельца, либо за счет прямого расщепления**). Если соответствие неполное, происходит дестабилизация*** мРНК, сопровождающаяся невозможность трансляции с нее. В некоторых случаях микроРНК запускает образование RITS – RNA-induced translational silencing, который, опознавая комплементарные участки генома, вызывает гетерохроматизацию найденных районов, сопровождающуюся метилированием ДНК, модификацией гистонов (метилирование лизинов хвоста H3) и привлечением структурных белков упаковки ДНК.
|
|
|
* pri-miRNA часто составлен из нескольких идущих друг за другом шпилек.
** - расщепление происходит за счет домена PIWI/RNaseH
*** - репрессия трансляции связана с взаимодействием Argonaute с 5’-кэпом мРНК.
siRNA отличаются от микроРНК, главным образом, отсутствием шпилечной структуры (hairpin loop) и характерны свисающим концом длиной 2 нуклеотида на каждом 3’-конце дуплекса. Предшественник siRNA представляет собой двухцепочечную РНК. Путь микроРНК отличается, поскольку все микроРНК производятся эндогенными некодирующими генами.
Образование siRNA в клетке возможно опять же двумя путями: экзогенное появление двухцепочечной РНК (сигнал присутствия вируса), либо синтез двухцепочечной РНК на матрице ДНК (двунаправленная транскрипция, транскрипция инвертированных повторов).
А дальше, механизм регуляции экспрессии сходен с механизмом с участием микроРНК. Двухцепочечная РНК процессируется Dicer’ом, образуются siRNA, который вместе с белком Argonaute формирует RISC. siRNA также могут входить в состав RITS.
(на всякий случай) Способы регуляции микроРНК: изменение уровня микроРНК, оверэкспрессия генов микроРНК, ингибиторы РНК, РНК-мимики, введение протекторов (защищают сайт, комплементарный микроРНК, в 3’-НТО), генетический нокаут генов микроРНК.
|
|
|
4. Каким образом малые РНК можно использовать для направленной регуляции уровня синтеза отдельных белков?
Для этого используется метод РНК-интнрференции для подавления экспрессии отдельных генов.
Вот, кстати, неплохой видео-файл: https://vk.com/video-60511457_171527362
Кратко: зрелая МикроРНК выходит из ядра в ц.п., там ее режет Dicer, появляются ее кусочки где-то около 21-25 пар оснований, потом этот кусочек связывается к комплексом RISC, в котором цепочки расшиваются и остаётся только одна, а вторая деградирует в ц.п., потом этот комплекс транспортируется к матричной РНК и там происходит комплементарная сшивка микроРНК комплекса с матричной РНК. Если микроРНК полностью комплементарна мРНК-мишени, то комплекс RISC разрезает матричнуюРНК и она распадается. Если же полной комплементарности нет, то просто трансляция не может идти в этом участке.(см в конце картинку, там все понятно).
Подробнее: Зрелая микроРНК является частью активного РНК-индуцируемого комплекса выключения гена (RISC), куда также входят Dicer и многие другие белки. RISC также известен как микроРНК-рибонуклеопротеиновый комплекс. Процессинг пре-микроРНК, осуществляемый Dicer, вероятно, связан с распадом дуплекса. В miRISC включается только одна цепь дуплекса, выбранная на основании её термодинамической нестабильности и более слабому, по сравнению с другой цепью, спариванию оснований. На выбор цепи также может повлиять наличие шпильки(см билет про биогенез МикроРНК). Вошедшая в miRISC цепь называется «направляющей». Другая цепь, называемая «пассажирской», обладает меньшей энергией в стабильном состоянии и в норме деградирует. В некоторых случаях обе цепи дуплекса становятся функциональными микроРНК и действуют на различные виды мРНК. Вошедшая в состав RISC микроРНК играет роль матрицы, распознающей определённую последовательность на мРНК-мишени.
Центральную роль в функционировании RISC играют белки семейства Argonaute (Ago). Эти белки необходимы для микроРНК-индуцированного выключения. Они связывают зрелую микроРНК и ориентируют её подходящим образом для взаимодействия с мРНК-мишенью. Некоторые белки семейства Argonaute, например, Ago2 человека, непосредственно разрезают транскрипт-мишень. Белки этого семейства также могут привлекать дополнительные белки для осуществления репрессии трансляции.
|
|
|
Выключение гена может осуществляться путём деградации мРНК или предотвращения её трансляции. Если микроРНК полностью комплементарна мРНК-мишени, то Ago2 может разрезать мРНК и привести к её непосредственной деградации. Если же полной комплементарности нет, то выключение достигается через предотвращение трансляции.
5. Что такое эпигенетическое наследование? Приведите примеры эпигенетических модификаций?
Эпигенетическое наследование – это паттерн экспрессии генов. Но сюда же можно отнести и пространственно-временную организацию репликации ДНК, становление и поддержание пространственной архитектуры ядра и таких специфических хроматиновых доменов как центромеры и теломеры, а также поддержание доменной организации хроматина в целом.
Эпигенетика – наследуемые изменения генной активности, которые не закодированы в последовательности ДНК.
Эпигенетические изменения: как правило обратимые, не затрагивают изменений первичной структуры ДНК, бывают долговременные и кратковременные, множество взаимосвязанных механизмов.
Типы эпигенетических модификаций:
1) ДНК-метилирование, Метилирование цитозина и аденина не нарушает способность к комплементарному взаимодействию, но стабилизирует двойную спираль ДНК и распознается многочисленными белками. Происходит с участием S-аденозилметионина (SAM) (донор метильной группы), может происходить “спонтанно” без участия ферментов.
В результате дезаминирования метилированного цитозина возникает тимин, что часто происходит в клетке и приводит к мутации, закрепляемой при репликации ДНК. Наиболее эффективно “спонтанно” метилируется цитозин в мотиве CpG.
У эукариот метилирование ДНК – один из ключевых механизмов регуляции онтогенеза и клеточной дифференцировки, а также подавления экспрессии чужеродных последовательностей и мобильных элементов. Метилирование в основном происходит пострепликативно, наименьшая суммарная активность метилаз - в G1 фазе клеточного цикла, увеличивается к S-фазе и опять падает в G2/М. Статус метилирования ДНК эукариот обратим, существует равновесие между метилированием и деметилированием. Деметилирование может быть активным (катализируется ферментами) и пассивным (отсутствие метилирования в очередном цикле репликации).
|
|
|
В клетках млекопитающих действуют по крайней мере две системы метилирования, за которые отвечают разные метилазы: метилирование de novo - вносит элементы изменчивости в профиль метилирования и поддерживающее метилирование - обеспечивает поддержание уже сформированного профиля (уровень точности>99%).
Функции ДНК-метилирования: поддержание структуры хроматина и стабильности хромосом, сайленсинг повторенных и интегрированных чужеродных последовательностей, механизм защиты против эффектов встраивания чужеродной ДНК, тканеспецифичное ненаследуемое долговременное подавление экспрессии генов на уровне транскрипции, формирование профиля экспрессии, характерного для данного типа клеток.
Дефекты системы метилирования, в т.ч. активности белков, связывающихся с метилированной ДНК, приводят к тяжелым наследственным заболеваниям (канцерогенез, диабет 2 типа, синдром Ретта и др.)
2) вариантные формы гистонов – коровые гистоны (за исключением Н4) существуют в разных формах (вариантах). Пул гистона Н3 в клетке состоит из вариантов Н3.3 (требуются в течение всего клеточного цикла), CENP-A и H3.1, H3.2 (синтезируются в S-фазе). Н3.3 ассоциирован с транскрипционно активными областями генов и богат посттрансляционными модификациями. H3.2 несет репрессирующие модификации, а H3.1 и активирующие, и репрессирующие.
Теперь то же самое, но подробнее: В ходе репликации в хроматин встраиваются только основные варианты гистона H3. Другие варианты, такие как H3.3 и CENPA транскрибируются на других этапах клеточного цикла и встраиваются в хроматин независимо от репликации при помощи специальных гистоновых шаперонов. Вариант H3.3 встраивается в такие участки хроматина, где происходит наиболее быстрый обмен гистонов. Как правило, это транскрипционно активный хроматин. Во время сборки хроматина в репликационной вилке все H3.3 гистоны будут приходить только из родительских нуклеосом, то есть, будет происходит разбавление метки H3.3. Однако, судя по всему, разбавление H3.3 и его модификаций в два раза в ходе репликации не влияет на транскрипционный статус соответствующего района. Если же ген продолжает активно экспрессироваться, будет происходить быстрая замена H3.1 на H3.3. Модификации гистонов, связанные с унаследованными молекулами H3.3, могут привлекать факторы, которые модифицируют вновь встроенные H3.3, а также создают метки активного хроматина в H3.1. Показано, что, будучи в соседстве с нуклеосомами, несущими H3.3, нуклеосомы с вариантом H3.1 накапливают метки активного хроматина.
|
|
|
Вариант гистона H3 - CENPA определяет положение центромеры. Связывание CENPA с центромерами является исключительно стабильным, и практически не подвержено динамике в ходе клеточного цикла. Исследования, проведенные на клетках млекопитающих, показали, что включение новых CENPA в центромеры происходит в очень коротком промежутке клеточного цикла – поздней телофазе – ранней G1. Центромерная ДНК реплицируется в S фазе, при этом родительские CENPA нуклеосомы распределяются между дочерними цепями. Следовательно, после репликации хроматин в центромерах несет только половину соответствующей метки до окончания S фазы, всю последующую фазу G2 и большую часть фазы M. До конца не ясно, в каком виде центромерный хроматин «дожидается» встройки вновь синтезированных центромерных 10 нуклеосом. Наиболее вероятно, что в ходе репликации центромерный хроматин частично упаковывавется в нуклеосомы, несущие H3.1, которые затем будут заменены на другие, содержащие CENPA. Можно предположить, что в хроматине временно будет пониженная концентрация нуклеосом.
3) Ремоделирование хроматина — процесс перемещения нуклеосом по ДНК, приводящий к изменению плотности нуклеосом или к расположению их на определенном расстоянии друг от друга (изменение позиции нуклеосомы АТФ-зависимым путем). Ремоделирование осуществляется специальными белковыми комплексами, при этом затрачивается энергия в виде АТФ.
Ремоделирование — ключевой процесс в инициации транскрипции, репликации, связывании транскрипционных факторов, поддержании статуса хроматина (активный/неактивный). Ремоделирование приводит к активации транскрипции генов при образовании открытого хроматина.
Хроматин — это комплекс ДНК с белками, прежде всего, с белками-гистонами. Гистоны формируют нуклеосому, вокруг которой накручивается ДНК, в результате чего обеспечивается её компактизация в ядре. От густоты расположения нуклеосом в активно экспрессирующихся участках генома зависит интенсивность экспрессии генов. Хроматин, свободный от нуклеосом, называется открытым хроматином. Ремоделирование хроматина — это процесс активного изменения «густоты» нуклеосом и сродства гистонов с ДНК.
4) РНК-интерференция - это группа механизмов сиквенс-специфичного подавления экспрессии генов с участием комплементарной им двуцепочечной* РНК (дцРНК). В дальнейшем было показано участие сходных механизмов не только подавления, но и активации генов, и смысл термина несколько “размылся”.
РНК-интерференция – древний и консервативный механизм РНК-зависимого сайленсинга. Молекулы РНК участвуют в реализации многих эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генома:
· Транскрипционный генетический сайленсинг (transcriptional gene silencing - TGS) – запрет на транскрипцию. Примеры: импринтинг, инактивация Х-хромосомы, РНК- индуцированный транскрипционный сайленсинг (RNA-induced transcriptional silencing - RITS) – происходит в ядре!
· Посттранскрипционный генетический сайленсинг (posttranscriptional gene silencing - PTGS) - запрет на синтез белка HDGS Homology Dependent Genetic Silencing =CTGS Co-transcriptional Gene Silencing
Процессы РНК-интерференции обнаружены в клетках многих эукариот: у животных, растений и грибов. Система РНК-интерференции играет важную роль в защите клеток от вирусов, паразитирующих генов (транспозонов), а также в регуляции развития, дифференцировки и экспрессии генов организма.
Процесс РНК-интерференции начинается с действия фермента Dicer (РНКаза III), который разрезает длинные молекулы двуцепочечной РНК (dsRNA) на короткие фрагменты порядка 21—25 нуклеотидов, называемые siRNA. Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют «направляющей», эта одноцепочечная РНК далее включается в состав РНК-белкового комплекса RISC. В результате активности RISC одноцепочечный фрагмент РНК соединяется с комплементарной последовательностью молекулы мРНК и вызывает разрезание мРНК белком Argonaute, либо ингибирование трансляции и/или деаденилирование мРНК. Эти события приводят к подавлению экспрессии (сайленсингу) соответствующего гена, эффективность которого ограничена концентрациями молекул малых РНК — siRNA и микроРНК.
Ключевые события: расщепление дцРНК-индуктора до коротких дцРНК, взаимодействие активных цепей коротких дцРНК с РНК-мишенью по принципу комплементарности в составе рибонуклеопротеинового комплекса с обязательным участием Ago-белков.
В качестве индуктора может выступать РНК самого разнообразного происхождения. Механизмы сайленсинга отличаются большим разнообразием, сайленсинг может быть индуцирован искусственно. Возможно эпигенетическое наследование эффектов РНК-интерференции.
5) модификации гистонов (ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, АТФ-рибозилирование, сумоилирование, убиквитинирование). Модификации могут быть активирующими и репрессирующими.
Гипотеза гистонового кода
Эта гипотеза предполагает, что существуют модификации гистонов, которые могут приводить к активации либо репрессии транскрипции.
Модификации гистонов не имеют прямого влияния на структуру хроматина. Они либо понижают положительный заряд на хвостах гистонов, что приводит к их диссоциации от ДНК, либо способствуют связыванию белков, распознающими модифицированные гистоны. Например, хромодомен белка HP1 связывается с H3K9me. Подобный домен в белке Polycomb (Pc) распознает H3K27me.
Модификации на двух соседних аминокислотных остатках могут влиять друг на друга. Например, метилирование 9-ого лизина гистона Н3, который связывает белок HP1. В течение митоза и конденсации хроматина фосфорилируется 10-й серин, что приводит к снижению связывания HP1 с Н3K9me. Это связывание еще больше снижается, когда Н3 ацетилируется по 14-ому лизину. Различные модификации гистонов распознаются разными белками, имеющими специфические связывающие домены (такие как бромодомены и хромодомены). Эти белки могут иметь разнообразные функции, такие как рекрутирование других белков или ферментативную активность, таким образом выступая в качестве механизма перевода информации, закодированной в модификациях гистонов.
|
|
|
