 |
Препаративные центрифуги и их применение.
|
|
|
|
Электронные пипетки
Новым этапом в развитии технологии дозирования явились электронные пипетки. Их представила на рынок дозирующих устройств финская компания BIOHIT.
Они могут выполнять следующие функции:
1. простое дозирование;
2. дозирование вязких жидкостей;
3. многократное дозирование равных объемов (функции диспенсера-степпера);
4. дозирование двух жидкостей — разведение (функции дилютера);
5. последовательное многократное дозирование различных объемов, задаваемых программно;
6. перемешивание жидкостей;
7. последовательный забор равных объемов жидкостей, и после набора суммарной дозы — автоматический сброс ее (что в многоканальном исполнении пипетки создает, в частности, удобства для промывки планшетов при ИФА);
8. выбор скорости забора и сброса жидкостей.
Микропроцессорное управление, быстродействующий микродвигатель, жидкокристаллический дисплей, аккумуляторная батарея и другие технологические достижения обеспечивают электронным микродозаторам следующие возможности и преимущества в сравнении с механическими:
— возможность замены нескольких обычных и специальных пипеток одной — электронной, в том числе таких, как диспенсер, дилютер и миксер;
— возможность работы в режиме дилютера с выполнением от 25 до 50 циклов выдачи доз после однократного забора суммарной дозы;
— возможность работы в качестве дилютера — смешивание двух реагентов в различной пропорции;
— перемешивание жидкостей прямо в пробирке;
— регулирование скорости забора и сброса жидкостей с различной вязкостью;
— возможность дозирования в диапазоне от 0,2 до 25000 мкл;
— более высокая точность дозирования и воспроизводимость по сравнению с механическими пипетками;
|
|
|
— легкость управления и небольшой вес позволяют в течение рабочего дня выполнять более 1000 манипуляций;
— автоматическая калибровка;
— возможность подзарядки от сети. Особо следует остановиться на прекрасных эргономических характеристиках электронных дозаторов в сравнении с механическими.
Центрифугирование
Центрифугирование позволяет разделить смесь, состоящую из двух или более компонентов с разной удельной плотностью, если по крайней мере один из этих компонентов — жидкость. Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью.
Скорость осаждения, или седиментации, зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционального угловой скорости ротора (ω), в рад/с) и расстоянию между частицей и осью вращения (r, в см): G= ω2х r
Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g (гравитационная постоянная) и называется относительным центробежным ускорением (ОЦУ), т.е.
ОЦУ=1,11х10-5х r (об/мин)2
Скорость седиментации сферических частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и от вязкости среды суспендирования. Время осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки обратно пропорционально скорости седиментации.
Смесь гетерогенных, приблизительно сферических частиц, различающихся по плотности и (или) размерам, можно выделить либо за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении, либо за счет распределения седиментирующих частиц вдоль пробирки, устанавливающегося через определенный промежуток времени. При разделении веществ необходимо учитывать и такие важные факторы, как плотность и вязкость среды. Описанными методами можно выделять клеточные органеллы из гомогенатов тканей. Основные компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: сначала целые клетки и их фрагменты, затем ядра, хлоропласты, митохондрии, лизосомы (или другие микротельца), микросомы (фрагменты гладкой и шероховатой эндоплазматической сети) и, наконец, рибосомы. '
|
|
|
Препаративное центрифугирование
Заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследовании. С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки, из предварительно очищенных препаратов.
· дифференциальное центрифугирование.
Основано на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например, гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый (гомогенный) осадок практически невозможно. Дифференциальное центрифугирование является самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомо-генатов тканей.
· зонально-скоростное центрифугирование
Метод заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос. Применяется для разделения гибридов РНК — ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.
· изопикническое центрифугирование.
При этой методике исследуемые частицы оседают на дно пробирки, а частицы меньшей плотности всплывут на поверхность жидкости. Используется при количественном разделении лизосом, митохондрий и пероксисом, основанном на удалении из гомогенной среды всех частиц с большей, чем у микросом, плотностью и последующем изопикническом центрифугировании выпавших в осадок тяжелых частиц.
|
|
|
· равновесное центрифугирование в градиенте плотности.
Для создания градиента плотности используют соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия, а также растворы сахарозы. Образец, например, ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлористого цезия. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а следовательно, и плотности CsCI, так как ионы цезия обладают большей массой. Под действием центробежного ускорения молекулы ДНК перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей плотностью. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является также одним из методов разделения и изучения липопротеинов плазмы крови человека.
Препаративные центрифуги и их применение.
Препаративные центрифуги можно подразделить на три основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги.
Центрифуги общего назначения обычно обеспечивают центрифугирование с максимальной скоростью 8000 об./мин и ОЦУ до 6000 g. Обычно центрифуги этого вида имеют большую емкость — от 4 до 6 дм3, что позволяет загружать их не только центрифужными пробирками на 10, 50 и 100 см3, но и сосудами емкостью до 1,25 дм3.
Скоростные центрифуги развивают скорость 25000 об/мин и ОЦУ до 89000 g. Камера ротора снабжена системой охлаждения для предотвращения нагревания, возникающего вследствие трения при вращении ротора. Как правило, скоростные центрифуги имеют емкость 1,5 дм3.
Препаративные ультрацентрифуги обеспечивают центрифугирование со скоростью до 75000 об./мин и максимальное центробежное ускорение 510000 g.
Центрифуги специального исполнения имеют различные конструктивные варианты исполнения под те или иные специальные задачи или виды исследований. К таким центрифугам относятся рефрижераторные центрифуги, центрифуги с нагревательной рубашкой и другие.
|
|
|
Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых и практически чистых препаратов макромолекул или частиц, например, рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала.
Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 100 000 об./мин, создавая при этом центробежное ускорение до 500000 g. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать. При фракционировании белков и ДНК за седиментацией наблюдают по поглощению в УФ-области спектра. Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков.
|
|
|
