Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение.

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, - метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности. Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе. Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изото-ническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресци-рующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими анти телами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

Живые вакцины. Методы получения

Живые вакцины - препараты, действующим началом в которых являются ослабленные тем или иным способом, потерявшие свою вирулентность, но сохранившие специфическую антигенность штаммы патогенных бактерий. Аттенуация (ослабление) возможна путѐм воздействия на штамм химических (мутагены) и физических (температура) факторов или посредством длительных пассажей через невосприимчивый организм. Так же в качестве живых вакцин используются дивергентные штаммы (непатогенные для человека), имеющие общие протективные антигены с патогенными для человека микробами. Примером такой вакцины является БЦЖ и вакцина против натуральной оспы. Возможно получение живых вакцин генно-инженерным способом. Принцип получения таких вакцин сводится к созданию непатогенных для человека рекмбинантных штаммов, несущих протективные антигены патогенных микробов и способных при введении в орг. человека размножаться и создавать иммунитет. Такие вакцины называют векторными. Вне зависимости от того, какие штаммы включены в вакцины, бактерии получают путѐм выращивания на искусственных питательных средах, культурах клеток или куриных эмбрионах. В живую вакцину, как правило, добавляют стабилизатор, после чего подвергают лиофильному высушиванию. В связи с тем, что живые вакцины способны вызывать вакцинную инфекцию (живые аттенуированные микробы размножаются в организме, вызывая воспалительный процесс проходящий без клинических проявлений), они всегда вызывают перестройку иммунобиологического статуса организма и образование специфических антител. Это так же может являться недостатком, т. к. живые вакцины чаще вызывают аллергические реакции. Вакцины данного типа, как правило, вводятся однократно. Примеры: сибиреязвенная вакцина, чумная вакцина, бруцеллѐзная вакцина, БЦЖ вакцина, оспенная дермальная вакцина.

Убитые вакцины

Инактивированные (убитые, корпускулярные или молекулярные) вакцины – препараты, в качестве действующего начала включающие убитые химическим или физическим способом культуры патогенных вирусов или бактерий, (клеточные, вирионные) или же извлечѐнные из патогенных микробов комплексы антигенов, содержащие в своѐм составе проективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины). Для выделения из бактерий и вирусов антигенных комплексов (гликопротеинов, ЛПС, белков) применяют трихлоруксусную кислоту, фенол, ферменты, изоэлектрическое осаждение. Их получают путем выращивания патогенных бактерий и вирусов на искусственных питательных средах, инактивируют, выделяют антигенные комплексы, очищают, конструируют в виде жидкого или лиофильного препарата.

Преимуществом данного типа вакцин является относительная простота получения (не требуется длительного изучения и выделения штаммов). К недостаткам же относятся низкая иммуногенность, потребность в трехкратном применении и высокая реактогенность формализированных вакцин. Так же, по сравнению с живыми вакцинами, иммунитет, вызываемый ими, непродолжителен. В настоящее время применяются следующие убитые вакцины: брюшнотифозная, обогащенная Vi антигеном; холерная вакцина, коклюшная вакцина

Анатоксины

Анатоксин (токсоид) — биологически активный препарат, получаемый путем обезвреживания бактериальных токсинов воздействием формалина при t° 39—40° (способ Рамона) или другими способами. Анатоксин обладает специфическими антигенными и иммуногенными свойствами исходного токсина и приобретает новые — безвредность, стабильность. Наиболее важным свойством анатоксина является иммуногенность, то есть способность вызывать развитие иммунитета у людей. Наиболее высокая иммуногенность у столбнячного, дифтерийного, ботулинического анатоксина.
Анатоксин применяют для иммунопрофилактики столбняка, дифтерии и других болезней. Анатоксин очень стоек (переносит повторное замораживание и оттаивание, хорошо противостоит высокой температуре) и весьма стабилен при длительном хранении.. Наиболее распространенными методами обработки анатоксинов являются осаждение нативных А. нейтральными солями (сернокислый аммоний), солями тяжелых металлов, преципитация кислотами (соляной, трихлоруксусной, метафосфорной) при изоэлектрической точке, а также осаждение при помощи этанола и метанола при низкой температуре и т. п. В результате удается получать препараты, которые по своим антигенным и иммуногенным свойствам значительно превосходят исходные нативные анатоксины. Получен ряд ассоциированных очищенных концентрированных сорбированных на гидроокиси алюминия А., применяемых для одновременной иммунизации против нескольких инфекций: ассоциированный дифтерийно-столбнячный А. для активной иммунизации против дифтерии и столбняка, дифтерийно-столбнячно-коклюшная вакцина для одновременной активной иммунизации против указанных инфекций.