 |
Гидросфера. Распространение бактерий в воде
|
|
|
|
Схема
 |
воду и, сохраняющихся в ней сравнительно короткое время. Вода неблагоприятная среда для размножения патогенных микроорганизмов, это связано с недостатком пищи, губительным действием солнечного света, с активностью бактериофагов, в изобилии попадающих в воду вместе с бактериями и находящими в ней благоприятные условия и действием других биологических и химических факторов. В результате поступления неочищенных сточных и промышленных вод водоемы загрязняются патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Микрофлора сточных вод состоит из обитателей кишечника человека и животных, включая представителей нормальной и условно-патогенной микрофлоры, а так же, от больных и носителей – патогенную флору. В водоемах, загрязненных испражнениями людей и животных, могут содержаться кишечные палочки, протеи, стафилококки, возбудители кишечных инфекций и др. Загрязнение водоемов микробами, в том числе патогенными, происходит при купании людей, животных, стирке белья. В воду нередко попадают трупы грызунов и других животных, павших от инфекционных заболеваний. Обнаружение в воде патогенных микроорганизмов служит показателем эпидемической опасности. Для оценки санитарно-гигиенического состояния воды производится санитарно-бактериологическое исследование. Это исследование основано на определении микробной обсемененности воды и обнаружении в ней, так называемых, санитарно-показательных бактерий.
К санитарно-показательным бактериям воды относятся представители обязательной (облигатной) микрофлоры организма человека и теплокровных животных, для которых средой обитания является кишечник. Они характеризуются тем, что постоянно выделяются в большом количестве из организма с испражнениями, не обитают в других местах, не способны интенсивно размножаться на объектах вне организма, сохраняются в окружающей среде в течение тех же сроков, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике.
|
|
|
Санитарно-показательными микробами воды являются кишечные палочки, фекальные стрептококки, обнаружение их в пробах говорит о свежем фекальном загрязнении.
Загрязненность воды относительно санитарно-показательных микроорганизмов определяется по наличию общих и термотолерантных колиформных бактерий.
Общие колиформные бактерии (ОКБ) – это грамотрицательные палочки, оксидазоотрицательные, не образующие спор, растущие на лактозосодержащих средах типа Эндо, сбраживающие с образованием альдегида, кислоты и газа лактозу (маннит, глюкозу) при температуре 37°С в течение 24-48 часов.
Термотолерантные колиформные бактерии (ТБК) – это грамотрицательные палочки, неспорообразующие, растущие на лактозосодержащих средах типа Эндо, сбраживающие с образованием альдегида, кислоты и газа лактозу при температуре 44°С в течение 24 часов, не обладающие оксидазной активностью и не растущие на цитратной среде.
Определение ОКБ и ТБК в воде, согласно действующим МУ 2.1.4.1018-01, проводится методом мембранной фильтрации и титрационным методом. Титрационный метод используется, если нет возможности провести исследование методом мембранной, по причине отсутствия материалов и оборудования, необходимых для выполнения или наличия в воде большого количества взвешенных частиц, микрофлоры, препятствующей получению изолированных колоний на фильтрах.
Микробное число – общее количество микроорганизмов, содержащееся в 1 мл воды.
Титр – минимальный объем, в котором определяется наличие 1-ой особи санитарно-показательных микроорганизмов.
|
|
|
Индекс – количество санитарно-показательных бактерий в 1 мл воды.
Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий в воде методом фильтрации (основной метод).
Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.
Объем исследуемой воды зависит от степени бактериального загрязнения воды:
водопроводная вода – 3 объема по 100,0 мл;
вода водоемов: чистая – в объеме 100,0; 50,0; 10,0; 1,0 мл; загрязненная сточными водами – в объеме 10,0; 1,0; 0,1; 0,01 мл; в зоне влияния выпуска сточных вод – 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл.
Определение ОКБ и ТБК в воде методом мембранной фильтрации.
При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл.
Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением следующих требований. Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя. Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум. При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают. Следует начинать с фильтрования проб обеззараженной воды или тех проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы. При фильтровании 1 мл исследуемой воды следует в воронку налить предварительно не менее 10 мл стерильной воды, а затем внести анализируемую воду. После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку можно поместить 3 - 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.
|
|
|
1 день. Исследуемые пробы фильтруют через мембранные фильтры (для получения стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл через один фильтр). Используют фильтровальный аппарат Зейтца. После окончания фильтрации фильтр снимают стерильным пинцетом и помещают фильтрующей поверхностью на среду Эндо по 3-4 фильтра, так чтобы они не соприкасались. Чашки с фильтрами инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37°С.
2 день. Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 ч.
Учету подлежат все лактозоположительные колонии: красные и темно-красные, с металлическим блеском и без него, выросшие на фильтрах. Подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТБК. Идентифицируют каждую выбранную изолированную колонию по морфологическим свойствам – готовят мазки-препараты и окрашивают по Граму; по биохимическим свойствам – способность ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа, оксидазную активность (для постановки пробы на оксидазу со среды Эндо снимают по 2-3 колонии каждого типа, наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином, при отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не меняется, при положительном – бумага окрашивается в синий цвет в течение 1 мин). По 2-3 колонии каждого типа пересевают на среды Гисса с лактозой и инкубируют при 44°С в течение 24 часов.
Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующим использования оптики. Тест Грегерсена: в капле 3%-ного водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются - реакция отрицательная.
|
|
|
Постановка подтверждающих тестов при наложении колоний или сплошном росте
Если на части или на всей поверхности фильтра наблюдается наложение колоний или сплошной рост, выполняют оксидазный тест путем помещения мембранного фильтра на кружок фильтровальной бумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом, или на диск СИБ-оксидаза, смоченный дистиллированной водой. При появлении первых признаков реакции, но не более чем через 5 мин, мембранный фильтр переносят обратно на среду Эндо. После четкого проявления реакции определяют результат. При появлении фиолетово-коричневого или синего окрашивания (в зависимости от примененного реактива) оксидазный тест считают положительным.
Если на фильтрах все колонии оксидазоположительные, они не учитываются и выдают ответ об отсутствии ОКБ и ТКБ и завершают анализ.
При отрицательной оксидазной реакции проводят рассев до получения изолированных колоний и подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ выше указанными методами.
Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37°С с образованием кислоты и газа.
Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44°С с образованием кислоты и газа.
При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл».
В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды.
Результат анализа рассчитывают по следующей формуле:
а х 100
Х =
V
где Х – число колоний в 100 мл исследуемой воды; V – профильтрованный через фильтр объем воды; а – число всех колоний, выросших на фильтрах.
Полученный результат выражают в КОЕ в 100 мл воды.
Общие и термотолерантные колиформные бактерии должны отсутствовать в 100 мл исследуемой воды.
При наложении колоний или сплошном росте на всех фильтрах (п.8.2.3.5) в случае подтверждения принадлежности к ОКБ и ТКБ выдается качественный результат «обнаружено ОКБ в 100 мл».
|
|
|
Если все колонии на фильтре оксидазоположительные или не подтвердилась их принадлежность к ОКБ и ТКБ, анализ завершается, в протоколе отмечают «зарост фильтров».
В обоих случаях анализ повторяют.
Определение ОКБ и ТБК в воде титрационным методом.
Титрационный метод может быть использован:
- при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;
- при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;
- в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.
Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.
В качестве среды накопления используют лактозо-пептонную среду.
1 день. При исследовании водопроводной воды делают посев 3 проб по 100,0 мл, 3 проб по 10,0 мл и 3 проб по 1,0 мл;
воды водоемов: не загрязненных сточными водами – в объеме 10,0; 1,0; 0,1; 0,01 мл; загрязненных сточными водами – в объеме 1,0; 0,1; 0,01; 0,001 мл; в зоне влияния сточных вод – в объеме 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл.
Причем для посевов больших объемов (100 мл и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую десятикратные количества необходимых веществ, а малые объемы засевает в обычную глюкозопептонную среду. Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37°С.
2 день. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо для получения изолированных колоний. Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованию они не подлежат.
Посевы на среде Эндо помещают в термостат при 37°С на 18-20 часов.
3 день. Просматривают посевы на среде Эндо, учитывают темно-красные или красные колонии, с металлическим блеском или без него. Идентифицируют каждую выбранную изолированную колонию по морфологическим свойствам – готовят мазки-препараты и окрашивают по Граму; по биохимическим свойствам – способность ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа, оксидазную активность. По 2-3 колонии каждого типа пересевают на среды Гисса с лактозой и инкубируют при 44°С в течение 24 часов.
Розовые, бесцветные, пленчатые колонии и колонии грибов на среде Эндо не учитываются.
При исследовании 3 объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в протоколе «обнаружены в 100 мл».
При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по таблицам.
Результат сообщают без доверительного интервала.
При отрицательном ответе на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе «не обнаружены в 100 мл».
Таблица. Расчет наиболее вероятного числа бактерий (НВЧ) в 100 мл питьевой воды централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения.
| Число положительных результатов из 3-х объемов | НВЧ бактерий в 100 мл | Довери-тельный интервал (95%) | Число положительных результатов из 3-х объемов | НВЧ бактерий в 100 мл | Довери-тельный интервал (95%) | ||||||
| по 100 мл | по 10 мл | по 1 мл | ниж-ний | верх-ний | по 100 мл | по 10 мл | по 1 мл | ниж-ний | верх-ний | ||
| 0,3 * * 0,3 * * * 0,6 * * * * * * * 0,4 0,7 * * 0,7 1,1 * * 1,1 * * * * * * * 0,9 | 0,1 0,2 0,1 1,1 1,2 0.3 0,1 0,2 0,3 0,3 0,2 0,3 0,3 0,4 0,1 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2 0,3 0,4 0,2 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,6 0,2 | 1,4 2,8 4,2 1,4 2,8 4,3 5,7 2,8 4,3 5,8 7,3 4,4 5,9 7,4 8,9 1,7 3,4 5,0 6,9 3,4 5,2 7,1 8,9 5,3 7,1 9,0 11,1 7,3 9,3 11,3 13,4 4,3 | 1,4 * * 1,5 * * * * * * * * * ≥ 240 | 0,3 0,4 0,6 0,3 0,4 0,6 0,7 0,5 0,6 0,7 0,9 0,6 0,8 0,9 1,1 0,5 0,8 1,4 2,0 0,9 1,6 2,5 3,4 2,0 3,2 4,6 6,2 5,1 9,3 23,5 - | 6,7 9,3 12,1 6,9 9,6 12,5 15,7 9,9 12,9 16,3 19,8 13,3 16,8 20,6 24,6 10,8 18,0 29,7 44,6 20,0 35,0 53,8 74,2 43,6 69,8 100,3 136,4 112,1 216,0 516,0 - |
Примечание: * - вероятность ниже допустимого уровня, количественный учет невозможен.
Таблица. Расчет наиболее вероятного числа бактерий (НВЧ) в 100 мл воды водоемов.
| Число положительных результатов из 3-х объемов | НВЧ бактерий в 100 мл | Число положительных результатов из 3-х объемов | НВЧ бактерий в 100 мл | ||||
| по 1 мл | по 0,1 мл | по 0,01 мл | по 1 мл | по 0,1 мл | по 0,01 мл | ||
| менее 30 60* 90* 61* 92* 120* 62* 93* 120* 94* 130* 160* 190* 110* 150* 150* 190* 150* 200* 240* 160* 200* 240* 290* | 200* 260* 270* 340* 350* 420* 360* 440* 530* 950* 1600* более 11000 |
Примечание: * - вероятность ниже допустимого уровня.
Определение спор сульфитредуцирующих клостридий в воде.
Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие палочки, анаэробы, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре, с образованием черных колоний, при температуре 44°С в течение 16-18 часов.
Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.
1 день. Пробы воды по 20 мл, предварительно прогретые на водяной бане при температуре 75°С в течение 15 минут (для удаления вегетативной флоры), фильтруют.
Определение методом фильтрования в пробирках
Перед посевом пробирки с железосульфитным агаром, расплавляют на водяной бане (не кипятить!). В течение посева поддерживают среду нагретой до (70 - 80)°С в водяной бане.
После фильтрования установленного объема воды мембранный фильтр фламбированным пинцетом берут за два противоположных края и согнутый в виде трубочки помещают в пробирку с горячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этом фильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки. Сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, помещая в емкость с холодной водой. Культивируют посевы при (44 +- 1)°С в течение 16 - 18 ч.
Определение методом фильтрования в чашках Петри
Чашки Петри диаметром 55 - 60 мм заливают тонким слоем железосульфитного агара. После фильтрации фильтр поместить фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную среду так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленным железосульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Культивируют посевы при (44 +- 1)°С в течение 16 - 18 ч.
2.4.1. Определение прямым посевом
Готовят железосульфитный агар во флаконах и пробу воды. В стерильные пробирки вносят:
- по 10 мл в 2 пробирки (объемом не менее 30 мл) или
- по 5 мл в 4 пробирки (объемом по 15 мл).
Посевы заливают горячим железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливать по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирку быстро охлаждают, помещая ее в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при (44 +- 1)°С в течение 16 - 18 ч.
2 день. Количественному учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды.
Результат анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды.
При отсутствии роста черных колоний на всех фильтрах дают ответ «не обнаружено в 20 мл воды».
При невозможности учета колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в протоколе отмечают «обнаружено в 20 мл». При необходимости получения количественного результата анализ повторяют.
Определение колифагов в воде
Колифаги – бактериальные вирусы, способные образовывать зоны лизиса (бляшки) газонной культуры E.coli (тест-культуры К 12 StrR) на питательном агаре через 18-20 часов инкубирования при 37°С.
Титрационный метод
Определение колифагов в питьевой воде заключается в предварительном накоплении колифагов в среде обогащения на культуре Е.coli и последующем выявлении зон лизиса (просветления) газона Е.coli на питательном агаре.
Подготовка тест-культуры Е. coli К12 Str(R). На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь, приготовленную следующим образом: культуру Е.coli засевают в пробирку со скошенным питательным агаром со стрептомицином. Через 18-20 ч инкубации при температуре 37°С произвести смыв бактерий с косяка 5 мл стерильного физиологического раствора (0,85%-ный раствор NaCl) и по стандарту мутности готовят взвесь Е.coli в концентрации 109 бактериальных клеток в 1 мл. Допускается использование 4-часовой бульонной культуры Е.coli, полученной путем подращивания в термостате при температуре 37°С. Концентрация 109 бактериальных клеток Е.coli содержится в 2 мл.
Проведение качественного анализа
1 день. В исследуемые пробы воды, объемом по 100 мл, добавляют по 10 мл питательного бульона с 1% раствором пептона (10-кратного концентрированного) и 1 мл смыва тест-культуры кишечной палочки или 2 мл 4-х часовой бульонной культуры. Инкубируют в течение 18-20 часов при 37°С.
2 день. Забирают 10 мл из полученного материала и добавляют к ним 1 мл хлороформа (для освобождения от бактерий), энергично встряхивают для раномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставляют до полного осаждения хлороформа при комнатной температуре.
В предварительно расплавленный и остуженный до (45 - 49)°С питательный агар добавляют приготовленный смыв бактерий Е. coli (п.8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара. В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 мл обработанной хлороформом пробы (не касаясь хлороформа) и заливают смесью расплавленного и остуженного до (45 - 49)°С питательного агара объемом 12 - 15 мл, а также одну дополнительную чашку Петри для контроля культуры Е. coli и осторожно покачивают для равномерного перемешивания пробы воды и агара. Для полного застывания чашки оставляют на столе при комнатной температуре на 10 мин. После застывания чашки переворачивают и помещают в термостат на (18 +- 2) ч при 37°С. При выполнении серии проб ставится общий контроль для всей серии.
3 день. Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветления нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. Результат выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ).В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 мл воды (результат качественный). Колифаги не должны обнаруживаться в 100 мл воды.
При наличии зон лизиса в контроле культуры результат считается недействительным.
Проведение количественного анализа
1 день. Исследуемую пробу воды в количестве 100 мл разлить на 6 объемов: 1 флакон 50 мл и 5 пробирок по 10 мл. В 50 мл пробы добавить 5 мл десятикратного питательного бульона и 0,5 мл смыва (или 1 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий Е.coli. В каждые 10 мл пробы внести по 1 мл десятикратного питательного бульона и 0,1 мл смыва (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий Е.coli. Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) Е.coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 18-20 часов.
2 день. Из объема 50 мл отлить в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавить по 1 мл хлороформа. Пробирки закрыть стерильными резиновыми или силиконовыми пробками, энергично встряхнуть для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставить при комнатной температуре не менее 15 мин для осаждения хлороформа. В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49°С питательный агар добавить приготовленный смыв бактерий Е.coli из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара. Приготовленную смесь разлить в чашки Петри: 1 чашку для контроля культуры Е.coli на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую пробу воды. При одновременном анализе нескольких проб воды ставится один контроль культуры Е.coli. После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделить на 6 секторов, промаркировать их в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей пробирки нанести пастеровской пипеткой (микропипеткой или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа). После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку поместить в термостат при 37°С на 18-20 ч.
3 день. Просмотр результатов осуществляется в проходящем свете. Учет проводится по наличию зон просветления (лизиса) на секторах газона Е.coli. При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха. Проба считается положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольными чашке.
Оценка проводится по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ) (таблица). В протоколе анализа указывается наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды и диапазон возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел - верхний предел) колифагов в 100 мл. Результат полуколичественный.
При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считать недействительным.
Таблица. Расчет наиболее вероятного числа (НВЧ) колифагов в 100 мл воды.
| Число положительных результатов | НВЧ, БОЕ в 100 мл | Вероятность | Нижний предел | Верхний предел | |
| из 1 объема по 50 мл | из 5 объемов по 10 мл | ||||
| 16,1 9,3 5,6 3,2 1,4 6,9 5,1 3,6 2,2 1,1 | 0,4095 0,3422 0,8218 0,3039 0,2500 0,0010 0,0060 0,0222 0,0671 0,1937 | 1,9 1,1 0,7 0,4 0,2 0,8 0,6 0,4 0,3 0,1 | 113,9 77,4 46,4 26,2 11,5 57,6 42,5 29,6 18,5 8,8 |
Прямой метод определения колифагов
Определение колифагов в питьевой воде заключается в исследовании нормируемого объема воды (100 мл) путем его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне Е.coli в чашках Петри с питательным агаром. Прямой метод выделения колифагов из воды проводят параллельно с титрационным при исследованиях по эпидемическим показаниям.
1 день. В питательный агар двойной концентрации, расплавленный и остуженный до 45 - 49°С, добавить смыв Е.coli из расчета 2,0 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара, перемешать. Исследуемые 100 мл воды разлить по 20 мл в большие пробирки, нагреть до 35-44°С и немедленно (не более чем через 5 мин по достижении требуемой температуры) разлить в 5 чашек Петри и сразу же внести в каждую чашку по 20 мл смеси агара с культурой Е.coli. Для контроля культуры Е. coli в одну чашку Петри внести 20 мл стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до 35-44°С, залить 20 мл приготовленного агара с Е.coli и осторожно перемешать.
Содержимое чашек осторожно перемешать и оставить при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром поместить дном вверх в термостат и инкубировать при температуре 37°С в течение 18-20 ч.
2 день. Просмотр посевов осуществляется в проходящем свете. Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать. Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5 - 7) мм в диаметре с четко выраженными либо стертыми границами. При высоких концентрациях фага наблюдается разная картина лизиса. Слияние негативных колоний дает «ажурный» газон Е.coli, рост единичных колоний Е.coli на фоне сплошного лизиса, либо полное отсутствие роста на чашке. При прямом посеве возможен лизис, маскируемый негомогенно застывшим агаром, а также закрытый сопутствующей микрофлорой. Капли конденсата и негомогенно застывший при прямом посеве агар могут приводить к образованию артефактов на газоне Е.coli, визуально напоминающих лизис.
Предварительный учет результатов можно проводить через 5-6 ч инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствии колифагов в воде.
Окончательный количественный учет прямого посева проводится через 18-20 ч. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 мл пробы воды.
Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: «обнаружено в 100 мл воды».
При получении отрицательного результата при работе прямым методом окончательный ответ выдается по результатам титрационного метода.
При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.
Таблица. Показатели безопасности питьевой воды
| Показатели | Единицы измерения | Нормативы |
| Термотолерантные колиформные бактерии | Число бактерий в 100 мл1) | Отсутствие |
| Общие колиформные бактерии2) | Число бактерий в 100 мл1) | Отсутствие |
| Общее микробное число2) | Число образующих колонии бактерий в 1 мл | Не более 50 |
| Колифаги3) | Число бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 100 мл | Отсутствие |
| Споры сульфитредуцирующих клостридий4) | Число спор в 20 мл | Отсутствие |
| Цисты лямблий3) | Число цист в 50 л | Отсутствие |
Примечание: 1) при определении проводится трехкратное исследование по 100 мл отобранной пробы воды; 2) превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в точках водозабора наружной и внутренней водопроводной сети в течение 12 месяцев, при количестве исследуемых проб не менее 100 за год; 3) определение проводится только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в распределительную сеть; 4) определение проводится при оценке эффективности технологии обработки воды.
Таблица. Количество и периодичность проб воды.
| Виды показателей | Количество проб в течение одного года, не менее | |
| Для подземных источников | Для поверхностных источников | |
| Микробиологические | 4 (по сезонам года) | 12 (ежемесячно) |
| Паразитологические | не проводят | не проводят |
Таблица. Виды определяемых показателей и количество исследуемых проб воды.
| Виды показателей | Количество проб в течение одного года, не менее | ||||
| Для подземных источников | Для поверхностных источников | ||||
| Численность населения, обеспечиваемого водой из данной системы водоснабжения, тыс. человек | |||||
| до 20 | 20-100 | свыше100 | до 100 | свыше 100 | |
| Микробиологические | 501) | 1502) | 3653) | 3653) | 3653) |
| Паразитологические | не проводят | 124) | 124) |
Примечание: - принимается следующая периодичность отбора проб воды: 1)-еженедельно, 2)-три раза в неделю, 3)-ежедневно, 4)-один раз в сезон года;
- при отсутствии обеззараживания воды на водопроводе из подземных источников, обеспечивающем водой население до 20 тыс. человек, отбор проб для исследования по микробиологическим показателям проводится не реже одного раза в месяц;
- на период паводков и чрезвычайных ситуаций должен устанавливаться усиленный режим контроля качества питьевой воды по согласованию с центром Госсанэпиднадзора.
|
|
|
