Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону

Практикум 2: Микроскопическое изучение живых (нативных) и окрашенных микробов.

Микроскопический метод в микробиологии. Методические основы.

Микроскопия в световом оптическом микроскопе.

Световой микроскоп состоит из механической и оптической части.

Механическая часть микроскопа - это штатив, состоящий из основания и колонки, к которой прикреплены тубус и предметный столик. В колонке имеются две винтовые системы для установки тубуса.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, объективов и окуляров. Осветительный аппарат расположен под предметным столиком. В большинстве микроскопов свет отражается от зеркала и, пройдя через линзы конденсора, фокусируется в плоскости препарата. В современных микроскопах освещение достигается с помощью вмонтированного в микроскоп источника света. Объективы представляют собой систему линз в металлической оправе. Передняя (фронтальная) линза - самая маленькая. От нее главным образом зависит увеличение микроскопа. Расположенные за ней линзы называются коррекционными, так как они предназначены для устранения недостатков оптического изображения. При микроскопии объектив погружают в каплю масла, поэтому объектив называют иммерсионным объективом (лат. immercio - погружение), а масло - иммерсионным маслом. Иммерсионный объектив требует особо осторожного обращения. Фронтальная линза имеет настолько короткое фокусное расстояние до исследуемого объекта, что опускать объектив нужно медленно, глядя сбоку, чтобы не раздавить препарат, что связано с порчей линзы. Окуляры имеют две линзы: верхняя называется глазной, а нижняя - собирательной. Окуляры обозначают по тому увеличению, которое они дают, например: х7, х10, х15 и т.д. Предел разрешения оптического микроскопа равен 0,2 мкм.

Окраска микроорганизмов — комплекс методов изучения структуры и морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур или исследуемого материала.

Фиксированные бактерии окрашиваются лучше живых, так как клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана живой клетки ограничивают проникновение в нее красителя.

Приготовление окрашенного препарата включает ряд этапов:

1) приготовление мазка;

2) высушивание мазка;

3) фиксацию мазка;

4) окраску;

5) высушивание.

Мазок готовят на чистых предметных стеклах, на середину которых наносят небольшую каплю воды и в нее с помощью бактериологической петли помещают исследуемый материал. Материал распределяют на стекле равномерным тонким слоем, размер мазка —1—2 см².

Препарат обычно высушивают при комнатной температуре на воздухе. Для ускорения высушивания допускается подогревание мазка в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки.

Высушенный мазок подвергается фиксации, при которой мазок прикрепляется к стеклу (фиксируется), а микробы становятся более восприимчивыми к окраске. Способов фиксации много. Наиболее простой и распространенный — фиксация жаром — нагревание на пламени горелки (препарат проводят несколько раз через наиболее горячую часть пламени горелки). В ряде случаев прибегают к фиксации жидкостями (этиловый или метиловый спирт, ацетон, смесь равных объемов спирта и эфира — по Никифорову).

После фиксации мазок окрашивают. Количество краски, наносимое на препарат, должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка. По истечении срока окрашивания (2—5 мин.) краску сливают и препарат промывают водой.

Существуют простые, сложные и дифференциальные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно употребляют одну краску, чаще всего красную — фуксин, или синюю — метиленовый синий. Фуксин красит быстрее (1—2 мин.), метиленовый синий — медленнее (3—5 мин.). Фуксин приготовляют в виде концентрированного карболового раствора (фуксин Циля), очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. Метиленовый синий приготовляется заранее в насыщенном спиртовом растворе, который стоек и может долго храниться.

Основные виды красителей, которые применяются в микробиологической практике:

Дают следующее окрашивание
красное	голубое (синее)	фиолетовое	желто-коричневое	зеленое
фуксин основной, нейтральный красный, конго красный	метиленовый и толуидиновый синий	генцианвиолет, метиленовый фиолетовый	хризоидин, везувин	бриллиантовый зеленый, малахитовый зеленый

Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней.
Механизм и этапы окраски по Граму

1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового. Через 1 минуту экспозиции перейти к п.2.

2. Нанести раствор Люголя на 1-2 мин (йод).

3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 сек. до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Возможно дополнительно промыть мазок водой.

5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин,

6. Промыть водой, высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону

1. На фиксированный мазок нанести карболовый раствор и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин.

2. Промыть мазок водой

3. Нанести 5% раствор серной кислоты (или 3% раствор смеси спирта с соляной кислотой) на 1-2 мин для обесцвечивания.

4. Промыть мазок водой

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин

6. Промыть водой, высушить и микроскопировать

Некислоустойчивые – обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислоустойчивые остаются окрашенными фуксином в красный.

 

Метод Бурри-Гинса используется для окраски капсульных бактерий и основан на том, что капсула не воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона по Бурри. Для этого черную тушь смешивают с культурой и высушивают. После этого проводят фиксацию в пламени горелки, окрашивают тела микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1 минуты и промывают водой 5-10 секунд.

 

Окраска по Леффлеру. Способ метахроматического выявления волютиновых зерен у коринебактерий. Для окраски используют щелочной раствор метиленового синего, который наносят на 3 - 5 мин на фиксированный мазок, после чего смывают водой, мазок высушивают и микроскопируют. Протоплазма бактерий окрашивается в голубой цвет, волютиновые зерна - в темно-синий.

 

Окраска по Нейссеру. Метод выявления волютиновых зерен у коринебактерий. Фиксированный мазок 2 - 3 мин красят уксуснокислым синим, 10 - 30 секунд обрабатывают раствором Люголя, слегка промывают водой и докрашивают в течение 30 секунд раствором везувина, высушивают и микроскопируют. Бактерии окрашиваются в желтый цвет, волютин -в темно-синий.

 

Окраска риккетсий по Здродовскому. Тонкий мазок фиксируют на пламени горелки. Окраску производят разведенным карболовым фуксином (10—15 капель фуксина на 10 мл бидистиллированной воды) в течение 5 минут. Окрашенный препарат промывают водой, а затем обесцвечивают в растворе органической или минеральной кислоты (0,5% лимонная кислота, 0,01% соляная кислота) в течение 2—3 секунд. Затем препарат промывают водой и докрашивают 0,5% раствором метиленовой сини в течение полминуты. В препарате на синем фоне будут видны окрашенные в красный цвет риккетсии.

 

Окраска по Романовскому—Гимзе. Краска Гимзы — смесь азура (органическая краска, получаемая из метиленового синего), эозина и метиленовой сини. Будучи в растворе синего цвета, она окрашивает клеточную цитоплазму в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь, капсулы бактерий — в красно-фиолетовый цвет.

Окраска по Романовскому—Гимзе является одним из основных методов при изучении морфологии простейших, спирохет, а также при исследовании форменных элементов крови.

Способ применения. К 10 мл дистиллированной воды нейтральной или слабощелочной реакции непосредственно перед окраской препарата прибавляют 10 капель краски и тотчас же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Если поместить препарат с краской в термостат при 37°, то окрашивание происходит быстрее (30—40 минут). Результаты окрашивания зависят от свойств воды, поэтому следует проверять ее реакцию.

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: