Бактериологические методы выделения возбудителей.

Забор материала для бактериоскопических, бактериологических и вирусологических исследований

Бактериологические методы выделения возбудителей.

При тонзиллофарингитах исследуются мазки из зева и носа. Мазки со слизистых оболочек берутся утром, натощак или не менее чем через 2 часа после еды, до полоскания, начала антибактери­альной терапии и других видов лечения. Для забора материала используют стерильный сухой ватный тампон, ук­репленный на палочке, который находится в стерильной пробирке (криовал).

Собирается материал с задней поверхности глотки, миндалин, участков воспаления или изъязвления слизистой зева.

После забора материала тампон помещают в криовал, отламывают выступающий конец аппликатора, плотно закры­вают крышку. Криовал маркируют.

Материал из зева и носа доставляется в лабораторию в специальных транспортных средах.

Для бактериологического исследова­ния стерильные пробирки с биоматериалом доставляются в лабораторию не позднее 3 часов после взятия материала. Окончательный результат бактериологического исследования получают через 48-72 часа.

При бактериальных синуситах и острых средних отитах (ОСО) аспират придаточных пазух носа и жидкость при тимпаноцентезе собирается в условиях специализированных отделений или кабинетов. При ОСО предварительно очищают наружный слуховой проход слабым раствором детергента. После прокола барабанной перепонки врач-отоларинголог шприцем собирает жидкость, помещает ее в специальную транспортную среду, которая доставляется в лабораторию. При самопроизвольной перфорации барабанной перепонки экссудат собирают стерильным тампоном, используя слуховое зеркало, однако такой экссудат часто обсеменяется микроорганизмами наружного слухового прохода (например, стафилококки, синегнойная палочка), что необходимо учитывать при интерпретации полученного результата.

При инфекциях нижних отделов респираторного тракта исследуется мокрота. Накануне пациента инструктируют о правилах забора материала. Утром пациент должен предварительно почистить зубы, десны, язык, слизистую оболочку щек зубной щеткой (без пасты или порошка!) и прополоскать рот теплой кипяченой водой. Если мокрота отделяется плохо, накануне пациент может принять отхаркивающие средства или провести ингаляцию с физраствором. Детям грудного и раннего возраста полость рта протирают сте­рильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором.

Мокрота собирается стерильным ватным тампоном, укрепленным на палочке, которая помещается в стерильную пробирку, закупоривается и направляется в лабораторию. Дети старшего возраста мокроту сплевывают в стерильный флакон. У детей грудного возраста для получения мокроты необходимо стерильным штапелем вызвать рефлекторный кашель надавливанием на корень языка.

На бактериологическое исследование необходимо направлять и лаважную жидкость, получаемую при проведении диагностических и лечебных бронхоскопий.

Сроки доставки мокроты в лабораторию не должны были превышать 1,5-2 часа с момента ее получения (допускается хранение в холодильнике, или доставка в холодном контейнере, но не более 6 часов).

При коклюше забор материала для бактериологического исследования производится двумя заднеглоточными тампонами – сухим и увлажненным забуференным физиологическим раствором.

При подозрении на дифтерию материал для исследования у больного берется из ротоглотки, носа и других мест в зависимости от локализации патологического процесса отдельными тампонами.

Техника взятия мазка. Больной широко открывает рот, одной рукой врач шпателем надавливает на корень языка книзу, другой рукой из­влекает из про­бирки тампон и осторожно, не прикасаясь к слизистой щек и языку, подводит его к миндалине. Вращательными движениями тампона необходимо захватить слизь с пораженных миндалин на границе воспалительного очага с налетами и здоровых тканей. При отсутствии наложений (налета) слизь забирают с поверхности миндалин, небных дужек, язычка. Материал засевают на кровяную теллуритовую среду Клауберга.

Для диагностикименингококковой инфекции забор слизи производят носоглоточным тампоном на согнутой под углом 130° палочке с задней стенки носоглотки, заводя за uvula. Посев взятой слизи проводится у постели больного в чашки Петри с плотной питательной средой (сывороточный агар с ристомицином, линкомицином). При посеве материала на чашку Петри рукой, удерживающей ее, приподнимают крышку настолько, чтобы прошла петля или тампон и по поверхности агара (стараясь не царапать питательную среду) параллельными штрихами, в верхней части густо, а затем штрихами на расстоянии 0,5 см распределяют материал для посева. Тампон быстро вынимают и опускают в дезраствор. Чашку Петри тотчас за­крывают и помещают в термостат при температуре 37°С вверх дном, обяза­тельно подписав ее. Пробирку с тампоном или чашку Петри доставляют в лабораторию в биксе с грелкой при температуре 37°С.

При бактериоскопии в мазке видны грамположительные диплококки, располагающиеся внутри- и внеклеточно.

Кровь для бактериологического исследования (на стерильность) забирают из вены с соблюдением требований асептики в количестве не менее 5 мл. Кровь из шприца помещается в стерильные флаконы с питательной средой, заранее полученные из бактериологической лабо­ратории. Пе­ред вливанием крови во флакон его горлышко должно быть обожжено пламенем. Соотношение крови и среды должно быть 1:10. Для исклю­чения случайного загрязнения крови при манипуляции рекомендуют производить посев крови не в один, а несколько флако­нов.

Мочу для бактериологического исследования собирают во время мочеиспускания, среднюю порцию (15-25 мл). Перед забором мочи проводят туалет наружных половых органов кипяченой водой, мылом (без триклозана!).

Рвотные массы и промывные воды желудка (первые порции) для бактериологического исследования собирают в стерильную плотно закрывающуюся посуду.

Для бактериологического исследования кала используют нативный материал, выбирая стерильным шпателем или ложечкой каловые массы, содержащие слизь, гной. Кал, содержащий кровь, на исследование не отбирают, так как в крови содержатся бакте­риостатические вещества, сдерживающие рост микроорганизмов на питательных средах. Материал помещают в стерильную пробирку с 0,5 мл глицериновой смеси или физиологического раствора, которую закрывают стерильной пробкой и отправляют в лабораторию на исследование не позже 2-х часов после забора. При невозможности своевременной доставки пробирки помещают в холодильник и направляют на исследование не позднее 12 часов после забора. Посев производят на среды Эндо, Плоскирева.

При исследовании на холеру (форма 30) материал (рвотные массы, испражнения, желчь) помещается в пробирку с 1% пептонной водой или погружается в пробирку с транспортной средой Кери Блейр.

При по­дозрении натифо-паратифозное заболевание у всех лихорадящих больных с не­установленным диагнозом проводят бактериологическое исследование крови (гемокультура) на протяжении всего лихорадочного периода. У больных, получающих антибактериальные препараты, пробы необходимо собирать непосредственно перед введением (приемом) следующей дозы препарата. Для посева крови используют 20% желчный бульон или среду Раппо­порта. Стерильным шприцом из локтевой вены берут кровь на первой неделе заболевания в количестве 5 мл и засевают во флаконы с теплым буль­оном у постели больного в соотношении 1:10 (при меньшем объеме питательной среды кровь может оказать бактерицидное действие на возбудителя). Положительные результаты гемокультуры чаще удается получить при посевах крови на 1-й неделе заболевания.

Бактериологическое обследование содержимого розеол. Материал собирают асептически. Для этого участок кожи над розеолами обрабатывают 70% этиловым спиртом, затем протирают ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9% раствором хлористого натрия, и осушают стерильным тампоном.

На место скарификации наносят каплю желчного или физиологического раствора, смешивают с выступившей тканевой жидкостью и собирают пастеровской пипеткой или аналогичным одноразовым стерильным устройством в пробирку с одной из жидких сред обогащения (желчный бульон, среда Рапопорт и др.).

Посев костного мозга (миелокультура) проводится очень редко, только по особым клиническим показаниям при отсутствии других лабораторных данных, подтверждающих диагноз брюшной тиф или паратиф, т.к. эта инвазивная процедура достаточно травматична. Забор материала для исследования проводят только в условиях стационара при наличии соответствующего специалиста. Высеваемость возбудителя составляет 90-95%.

Бактериологическое обследование испражнений (копрокультура). Пробы испражнений отбирают сразу после дефекации из дезинфицированного и тщательно вымытого судна, на дно которого был помещен лист плотной чистой бумаги. Для посева кала стерильной стеклянной палочкой или шпателем бе­рут 2-3 грамма испражнений. Материал, помещенный в стерильный контейнер, доставляется в лабораторию в течение 2 ч. Если материал невозможно доставить в лабораторию в течение 2 ч, его собирают в консервант (транспортную систему со средой). Объем материала не должен превышать 1/3 объема среды.

Пробы испражнений, собранные непосредственно из прямой кишки с помощью ректального тампона, используют преимущественно для объективизации диагноза (МУ 4.2.2039-05). Взятие материала осуществляется средним медицинским персоналом. Важно отметить, что попадание транспортных сред на слизистую прямой кишки недопустимо! Поэтому ректальный тампон должен погружаться в транспортную среду только после взятия материала. Больного просят лечь на бок с притянутыми к животу бедрами и ладонями развести ягодицы. Зонд-тампон вводят в задний проход на глубину 4-5 см и, аккуратно вращая его вокруг оси, собирают материал с крипт ануса. Осторожно извлекают зонд-тампон и погружают его в транспортную среду. Транспортирование тампона без среды не допускается.

Посев производят прямым способом на чашку Петри со средами Плоскирева, Левина, с висмут-агаром или на среды обогащения (селенитовая, среда Мюллера).

Посев мочи (уринокультура) проводится для диагностики с первых дней заболевания и вплоть до выписки больного, а также с целью выявления бактерионосительства. Так как при тифе и паратифах выделение возбудителя с мочой происходит периодически и кратковременно, исследования мочи необходимо проводить повторно с промежутками 5-7 дней. Собирают 20-30 мл мочи с соблюдением условий, исключающих ее инфицирование. Вне зависимости от способа получения мочи она должна быть доставлена в лабораторию в течение 2 ч. В крайнем случае, допускается хранение мочи в течение ночи в холодильнике. Затем проводят посев мочи прямым способом на плотные среды и среды обогащения.

Посев желчи (биликультура) противопоказан в лихорадочном пе­риоде. Желчь, полученную при дуоденальном зондировании (не ра­нее 8-10 дня нормальной температуры) с соблюдением стерильности засевают на чашки Петри по 0,5 мл или на среды обогащения по 1-2 мл или на простой бульон.

Предварительные результаты посевов крови – выделение S. typhi – получают через 2-3 дня, а окончательные – через 5-10 дней. Окончательные результаты бактериологического ана­лиза кала и мочи получают на 4-5 день, а желчи – на 7 день. Выделение гемокультуры подтверждает диагноз тифо-паратифозного заболевания. Выделение возбудителей из мочи обла­дает повышенной диагностической ценностью в связи с тем, что по­чечные носители встречаются редко. Копро-, урино- и биликультуры чаще всего используют для подтверждения бактериологического вы­здоровления от брюшного тифа и паратифа. Метод выделения розеолокультуры применяется ограниченно, по­скольку экзантема встречается не у всех больных. Наиболее высокий процент выделения палочек брюшного тифа получается при посевах костного мозга.

Методика бактериоскопии «толстой капли» используется в случаях подозрения на малярию, воз­вратный тиф, трипаносомоз, филяриоз, у длительно лихорадящих больных.

Техника проведения. Кожу пальца протирают спиртом и прокалы­вают стерильной иглой-копьем или толстой инъекционной иглой. Первую выступившую каплю крови вытирают сухой ватой, затем палец поворачивают проколом вниз и прикасаются обезжиренным предметным стеклом ко второй капле в 2-3 местах. Каждую каплю другим предметным стеклом (или иглой) размазывают в ровный, тол­стый диск диаметром 10-15 мм. Отпечатки высуши­вают при комнатной температуре не менее 2-3 часов и без предвари­тельной фиксации их окрашивают по Романовскому-Гимзе 30-45 ми­нут.

Приготовление тонкого мазка из крови. Показания: повышение температуры тела интермиттирующего характера, анемия, увеличение селезенки, подозрение на малярию, хроническое недомогание, прожи­вание в эндемичной зоне или недавний (неделя) выезд из нее.

Первую каплю крови с безымянного пальца левой руки удаляют сухой ваткой. К выступившей капле крови прикасаются нижней по­верхностью предметного стекла так, чтобы капля, величиной немного большей булавочной головки, оказалась на расстоянии 1,5-2 мм от его узкого края. Затем предметное стекло переворачивают каплей вверх и берут его в левую руку, а правой рукой устанавливают шлифованное стекло под углом 45° к первому (с наклоном в сторону капли) и ждут, пока кровь растечется вдоль края шлифованного стекла к углу, обра­зованному обоими стеклами. Легким движением прижимают шлифо­ванное стекло, продвигают его влево по предметному стеклу, не до­ходя 1-1,5 см от края. Мазок высушивают и отправляют в лаборато­рию.

Трактовка результатов исследования. В зараженных эритроцитах видны плазмодии малярии с голубой цитоплазмой и ярко-красным ядром (Pl. vivax, ovale, falciparum).

Вирусологические методы выделения возбудителей на клеточных культурах трудоемки и длительны, поэтому используются для ретро­спективной диагностики и расшифровки эпидемических вспышек ОРВИ, гриппа, кори, полиомиелита, энтеровирусных и др. заболеваний.

Для экспресс-диагностики острых вирусных инфекций используетсяиммунофлюоресцентный метод, основанный на выявлении вирусных антигенов и позволяющий диагностировать заболевание в течение 4-5 часов от момента доставки материала.

Материалом для изоляции респираторных вирусов служит отделяемое из глубоких отделов носовой полости, зева (ротоглотки). Материал отбирают в разгар заболевания (первые 3 дня болезни).

При взятии слизи из носа необходимо предварительно очистить носовые ходы или протереть слизистые сухим ватным фитилем и убрать корки. Тампон аппликатора следует осторожно ввести через ноздрю в носовую полость и сделать несколько осторожных вращательных движений, чтобы собрать отделяемое со слизистой оболочки носовой полости. Тем же аппликатором мазок берется из другой ноздри.

Аппликаторы для иммунофлюоресцентного исследования помещают в сухие пробирки. Транспортировку осуществляют в специальном контейнере в условиях холодовой цепи.

Для диагностики гриппа применяется метод ПЦР. Образцы, предназначенные для ПЦР диагностики гриппа, помещают в вирусную транспортную среду (2 мл). Материал следует хранить при температуре +4°C в течение 48 часов. Образцы нельзя замораживать в холодильнике при минусовой температуре. Рекомендуется совмещать мазки из полости носа и ротоглотки в одной пробирке.

Лабораторная диагностика ротавирусной и норовирусной инфекции. Используется электронная микроскопия, иммуноферментый анализ, полимеразная цепная реакция.

Пробу фекалий для выделения вирусов у детей раннего возраста забирают из подгузника в специальный стерильный контейнер; у пациентов старшего возраста – из помещенного в горшок или подкладное судно одноразового полиэтиленового пакета или одноразовой пластиковой емкости (чашка Петри). Затем нативные испражнения в количестве 1,0-2,0 г переносят в стерильный контейнер и доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 1 суток. Материал хранится при температуре 2-8°С – в течение 1 суток; при температуре минус 20°С – в течение 7 суток.

Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.

Лабораторная диагностика полиомиелита. Используется выделение вируса из фекалий. Отбор 1-й пробы фекалий проводится сразу при постановке диагноза, 2-й – с интервалом 24-48 часов. Обе пробы в стерильных флаконах доставляются в лабораторию в условиях холодовой цепи (при температуре +4°С).

Доставка отобранных проб должна быть осуществлена в течение 72 часов с момента взятия второй пробы. Хранение проб до отправки и при транспортировке осуществляется при температуре от 2 до 8°С. В отдельных случаях, если доставка проб в вирусологическую лабораторию Регионального центра по эпидемиологическому надзору за полиомиелитом и острыми вялыми параличами (ПОЛИО/ОВП) или в Национальную лабораторию по диагностике полиомиелита (НЛДП) будет осуществлена в более поздние сроки, то пробы замораживают при температуре минус 20°С и доставляют в замороженном виде.

Взятие одной пробы фекалий от детей в возрасте до 5 лет для лабораторного исследования в эпидемических очагах ПОЛИО/ОВП проводится в случаях:

- позднего выявления и обследования больных ПОЛИО/ОВП (позже 14 дня с момента появления паралича);

- неполного обследования больных ПОЛИО/ОВП (1 проба стула);

- при наличии в окружении мигрантов, кочующих групп населения, а также прибывших из эндемичных (неблагополучных) по полиомиелиту стран (территорий);

- при выявлении приоритетных («горячих») случаев ОВП.

Взятие проб фекалий у контактных детей до 5 лет для лабораторного исследования проводится до иммунизации, но не ранее 1 месяца после последней прививки против полиомиелита вакциной ОПВ.

Лабораторная диагностика энтеровирусной инфекции (ЭВИ). Подтверждается обнаружением энтеровирусов или их РНК в клиническом материале.

При подозрении на энтеровирусную инфекцию отбираются спинномозговая жидкость, отделяемое конъюнктивы, мазок отделяемого везикул, кровь, биоптаты органов (стерильные типы клинического материала); мазок (смыв) из ротоглотки/носоглотки, мазок отделяемого язв при герпангине, кал (нестерильные типы клинического материала).

Взятие определенного вида материала для исследования от больных ЭВИ и лиц с подозрением на заболевание осуществляется с учетом клинической картины.

Доставка клинического материала в лабораторию для исследований с целью установления этиологии возбудителя проводится не позднее 72 часов с момента отбора проб.

Этиологическая расшифровка случаев ЭВИ должна быть проведена не позднее 7-го дня с момента поступления проб в лабораторию.

К направляемым в лабораторию пробам необходимо приложить аккуратно заполненный сопроводительный документ.

Лабораторная идентификация вирусов кори и краснухи проводится вирусологическим и молекулярно-биологическим методами (ПЦР). Применяется в целях определения генотипа возбудителя кори или краснухи, для чего на 1-3 день с момента появления высыпаний у больного проводится отбор проб клинического материала (моча, носоглоточные смывы, ликвор) для исследований.

Сбор, хранение и транспортирование материала для вирусологических, серологических и молекулярно-биологических исследований осуществляется в установленном порядке.

Лабораторная диагностика Конго-Крым геморрагической лихорадки (ККГЛ). При отборе проб необходимо использование защитного костюма II типа, дополненного очками. Запрещается проводить следующие манипуляции: центрифугирование, встряхивание, пипетирование ртом.

Взятие проб крови в остром периоде заболевания должно производиться однократно. Материалом для выделения вируса ККГЛ является цельная кровь, плазма, сгусток крови.

Материал для вирусологических исследований забирают в ранние сроки от начала заболевания (до 7 дня). Эффективность выделения вируса в этот период приближается к 100%.

Кровь берут, соблюдая правила асептики, из локтевой вены в количестве 5 мл в острый период болезни (первые 5-7 сут.) и переносят в пластиковую пробирку с плотно закрывающейся (завинчивающейся) пробкой. Пробирка этикетируется. Этикетка делается из лейкопластыря и наклеивается на пробирку. На этикетке указываются фамилия, имя, отчество больного, вид материала, дата взятия.

Для вирусологического исследования консерванты не добавляют и инактивацию материала не проводят.

Если материал для вирусологических исследований может быть доставлен в лабораторию в течение 2-4 ч, то его транспортируют в термосе со льдом. Если время доставки материала превышает 4 ч, его замораживают и доставляют в лабораторию в сосудах Дьюара с жидким азотом или в термоконтейнерах с сухим льдом.

Цельную кровь замораживанию не подвергают. Необходимо отделить сыворотку крови от сгустка.

Материалом для молекулярно-генетического исследования (ПЦР диагностика) служат образцы сыворотки и плазмы крови в первые дни болезни (до 5-7 дня). Сыворотку переносят в стерильные одноразовые пробирки объёмом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой.

Хранят сыворотку крови при температуре от 2°С до 8°С не более 3 сут. при температуре не выше минус 16°С – в течение 1 месяца, при температуре не выше минус 68°С – в течение 1 года. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала. При замораживании клинического материала его транспортировка должна проводиться также в замороженном состоянии.

Объектом для серологической диагностики исследования является кровь больного. Кровь отбирают дважды – на 5-7 и на 10-14 дни от начала заболевания.

Каждая проба сопровождается направлением.

Транспортировка крови, сывороток и секционного материала в вирусологическую лабораторию.

Для передачи в вирусологическую лабораторию в первичной герметично закрывающейся таре пробы помещают во вторичную тару, представляющую собой герметичный металлический или пластиковый пенал.

Транспортировать материал для вирусологического исследования следует в жидком азоте (сосуд Дьюара). При его отсутствии можно использовать термос с сухим льдом или термоконтейнер с хладоагентами, где создана отрицательная температура. Биологический материал от больных (трупа) с подозрением на ККГЛ отправляют в вирусологическую лабораторию в течение 24 часов.

Транспортировка материала осуществляется специально выделенным транспортом в сопровождении медицинского работника.

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: