 |
Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные – в синий
|
|
|
|
Практика по микре
Приготовление мазка
1.чистка стекла
2.нанесение материала
3.размазывание материала на предметном стекле(мазок)
4.высушивание
5.фиксация
6.окрашивание
7.микроскопирование.
2.Микроскопирование -способ исследования микрообъектов.
· Для изучения неокрашенных объектов используется фазово-контрастное устройство, с помощью которого можно получить четкое контрастное изображение прозрачных, не имеющих окраски микроорганизмов.
· При изучении внутриклеточных структур микроорганизмов, используется люминесцентная микроскопия, основанная на способности некоторых объектов при специальном окрашивании флюорохромами светиться в коротковолновых лучах света (ультрафиолетовых, синих и др.).
· Наиболее совершенными приборами, дающими возможность получать полезное увеличение объекта в 200-500 тыс. и более раз, являются электронные микроскопы, в которых вместо световых лучей используется поток электронов. С помощью электронных микроскопов удается рассмотреть белковые молекулы.
ПРАВИЛА ИММЕРСИОННОЙ МИКРОСКОПИИ
1. Микроскоп устанавливают в рабочее положение – увеличение объективов
2. Устанавливают освещение, включая лампу или направляя свет на зеркало микроскопа. Конденсор должен быть поднят до упора, диафрагма открыта (рис. №3)
3. На препарат наносят каплю иммерсионного масла
4. Препарат помещают на предметный столик и фиксируют его клеммами
5. Наблюдая сбоку, опускают тубус с объективом 90х, 100х макровинтами в масло почти до соприкосновения с препаратом
6. Затем, глядя в окуляр (7х, 10х), макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку четкого изображения
|
|
|
7. При микроскопии определяют взаимное расположение микроорганизмов, их размеры, форму, структуру, окраску
8. После просмотра препарата револьвер переводят на малое увеличение 8х и только после этого препарат снимают со столика
9. Фронтальную линзу объектива протирают марлей, смоченной чистым бензином или эфиром для удаления остатков иммерсионного масла
10. Затем опускают предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрывают микроскоп чехлом.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ
1. Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина
2. На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стекло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре
3. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время
МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ
1. На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом.! Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его
2. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру
3. Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40Х
Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания
СПОСОБ ГРАМА
1. На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1-2 мин
2. Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин
3. Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15-20 мин в зависимости от толщины мазка
4. Спирт смыть дистиллированной водой
5. Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2-3 мин
6. Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией
|
|
|
7. Микроскопия с иммерсией.
Грамположительные (Гр+) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные (Гр-) бактерии окрашиваются в красный цвет.
6. Нейссера метод окраски используют для выявления зерен волютина у возбудителей дифтерии и др. коринебактерий.
1.Фиксированный мазок 2 - 3 мин красят уксуснокислым синим
2.10 - 30 с обрабатывают р-ром Люголя, слегка промывают водой и докрашивают в течение 30 с р-ром везувина
3.высушивают и микроскопируют.
Бактерии окрашиваются в желтый цвет, волютин -в темно-синий.
ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ-ГИНСА
1. Приготовить мазок на предметном стекле по методу Бурри
2. Высушить на воздухе
3. Фиксировать химическим способом: погружение стекла в емкость со спиртом или сулемой – 10 мин, или со смесью Никифорова (спирт и эфир 1:1) – 15-20 мин
4. Осторожно промыть водой
5. На мазок нанести фуксин Пфейффера – 3-5 мин
6. Промыть Н2О
7. Высушить на воздухе
8. Микроскопия с иммерсией.
Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.
Препарат по Бурри – Гинсу под микроскопом: фон черный, клетки бактерий красные, капсулы неокрашенные (красители не воспринимают)
ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО
1. На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько капель 0,5% НCl, держать над пламенем спиртовки до образования паров
2. Высушивают и фиксируют физическим способом
3. Окрашивают по методу Циля-Нильсена:
1) На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза)
2) Н2О
3) 5% Н2SО4 (погружая 2-3 раза)
4) Н2О
5) Метиленовый синий 1 % - 3-5 мин
6) Н2О
4. Микроскопия с иммерсией
Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители.
Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка в голубой цвет
МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА
1. На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза)
2. Н2О
3. 5% Н2SО4 (погружая 2-3 раза)
4. Н2О
5. Метиленовый синий 1 % - 3-5 мин
6. Н2О
7. Микроскопия с иммерсией.
|
|
|
Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные – в синий
10. Существующие на настоящее время приказы и инструкции не запрещают кипячение как метод стерилизации хирургического инструментария. Хотя он не гарантирует их полного обеспложивания. Установлено, что при кипячении в 100°С происходит сворачивание белка, и большинство бактерий погибает, но, например, споры почвенного термофила выдержиают кипячение в течение 500 мин. Длительное кипячение выдерживают также споры столбняка, вирусы гепатита. Бактерии, укрытые землей, кровью, эксудатом, выдерживают кипячение неопределенно длительное время. Для стерилизации инструментария кипячением используются стационарные или переносные кипятильники (старое название — стерилизаторы). Перед кипячением в воду добавляется гидрокарбонат натрия до образования его 2% раствора. Длительность кипячения составляет 30 мин от момента закипания.
11. На настоящее время наиболее надежным методом стерилизации хирургического инструментария является стерилизация горячим воздухом (сухим жаром). Этим методом можно стерилизовать металлические, фарфоровые, стеклянные инструменты. При стерилизации изделий из синтетики, бумаги, текстиля, дерева они могут подвергаться обугливанию. Для стерилизации используются самые разные марки и типы воздушных стерилизаторов (старое название — сухожаровые шкафы) с электронной регуляцией и контролем времени и режима стерилизации. Стерилизация производится при 180°С в течение 60 мин.
Автоклавирование
Стерилизация - метод, обеспечивающий гибель в стерилизуемом материале вегетативных и споровых форм патогенных и непатогенных микроорганизмов.
Стерилизация, паровой метод (автоклавирование).
Надлежащая стерилизация в автоклаве возможна при строгом соблюдении правил подготовки биксов и их загрузки соответствующими изделиями, для чего следует:
• обработать внутреннюю поверхность бикса 70% спиртом и на его дно положить простыню с таким расчетом, чтобы затем ее концами накрыть содержимое бикса;
|
|
|
• заложить в бикс наборы резиновых изделий, перевязочного материала, белья;
• инструменты завернуть в полотенце или пеленку и заложить в бикс;
• после загрузки бикса разместить в нем 5 индикаторов: 4 - по внутренней стороне стенок бикса и 1 - в центре бикса (непрямой метод контроля стерильности);
• на крышке бикса зафиксировать бирку, на которой отметить: вид материала и лечебное отделение, для которого производится стерилизация инструментов и материалов;
• крышку бикса герметично закрыть. У бикса старого образца сдвинуть металлическую ленту-пояс и тем самым открыть окна на его стенках, которые после завершения стерилизации необходимо закрывать;
• после стерилизации на бирке бикса поставить дату и подпись медицинской сестры, проводящей
автоклавирование.
Возможны различные варианты комплектации биксов: только один вид материала, наборы для типичного или конкретного оперативного вмешательства.
Стерильность материалов, изделий, сроки сохранения:
• закрытые биксы старого образца – 72 часа;
• закрытые биксы нового образца – 20 суток;
• при открытом биксе любого образца стерильность материалов, изделий сохраняется до 24 часов;
• крафт-пакеты, заклеенные – 20 суток;
• крафт пакеты на скрепках – 3 суток.
При открытом крафт-пакете материалы и изделия должны быть использованы сразу.
13. Пастеризация — процесс одноразового нагревания чаще всего жидких продуктов или веществ до 60 °C в течение 60 минут или при температуре 70—80 °C в течение 30 мин[1]. Технология была предложена в середине XIX века французским микробиологом Луи Пастером. Применяется для обеззараживания пищевых продуктов, а также для продления срока их хранения
14. Кварцевание — процесс обработки (обеззараживания) помещения (воздуха) ультрафиолетовым излучением кварцевой лампы.В результате кварцевания воздух обогащается озоном, который, в свою очередь, также дезинфицирует воздух. Озон ядовит, поэтому после кварцевания помещение следует проветривать.
15.Дезинфектант – это химический препарат, используемый человеком для уничтожения микроорганизмов и поддержания санитарно-гигиенических норм. Новые дезинфицирующие вещества разрабатываются на основе таких традиционных групп химических соединений, как спирты, альдегиды, фенолы, перекиси, ПАВ и хлорсодержащие вещества. Кроме того, постоянно разрабатывается возможность их соединения для создания композитного дезинфицирующего средства.
16. Асептика — комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микробов в рану.
Антисептика (лат. anti — против, septicus — гниение) — система мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов в ране, патологическом очаге, органах и тканях, а также в организме больного в целом, использующая механические и физические методы воздействия, активные химические вещества и биологические факторы.
|
|
|
Реакция агглютинации
Реакция агглютинации представляет собой процесс склеивание и выпадение в осадок корпускулярного антигена (агглютиногена) под воздействием специфических антител (агглютининов) в растворе электролита в виде глыбок агглютината.
РА протекает в две фазы. Первая - специфическая (невидимая) - взаимодействие антител с антигеном, вторая - неспецифическая (видимая) - выпадение глыбок агглютината.
18. Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
Механизм. Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата — помутнение.
2-приготовление мазка из исследуемого материала
приготовить мазок из исследуемого материала
Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала. 1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала (моча, лик-вор и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету. 2. Приготовление мазков из крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови.
Второе — шлифованное — стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла (рис. 3). Толщин-а мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно-приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем протяжении. 3. Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца.
Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край. 4. Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу., После этого свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую часть.
3-выделение чистой культуры
При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.
Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.
При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий — элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.
Например, при бактериологической диагностике кишечных инфекций – среду Эндо, для выделения дифтерийной палочки используют теллуритовые среды, и т. д. При выделении условно-патогенных микроорганизмов при бактериологическом методе посев взятого материала осуществляют на универсальные питательные среды. Примером такой среды может служить кровяной агар.
Все манипуляции, которые связанны с выделением бактериальных культур, проводятся над пламенем горелки.
При выделении из патологического материала чистой культуры возбудителя, который существенно загрязнен посторонней микрофлорой, часто пользуются биологическим методом выделения чистой культуры. Делают это следующим образом: заражают исследуемым материалом чувствительных к возбудителю лабораторных животных. Еще один пример биологического метода – при исследовании больного на содержание в мокроте пневмококков, материал внутрибрюшинно вводят белым мышам. Из их крови через 4-6 часов получают чистую культуру пневмококка.
4)приготовление мазка с помощью импрессионной системы
На предметное стекло, при помощи бактериальной петли, нанести мазок. Высушить его на воздухе, а затем зафиксировать в пламени спиртовки. Мазок должен быть равномерно растертым и не густым.
Фиксированный мазок – носит название ПРЕПАРАТ (5 баллов).
2. Приступить к окраске по Граму (5 баллов).
Этап 1: на препарат нанести несколько капель раствора генцианвиолета. Окрашивать 1 – 2 минуты.
Слить остатки красителя.
Этап 2: не промывая водой, нанести раствор Люголя до почернения (1 мин.), затем раствор слить.
Этап 3: не промывая водой, нанести 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с).
Этап 4: промыть препарат водой. Э тап 5: докрасить фуксином 3 мин, промыть водой и высушить
3. Микроскопировать окрашенный препарат при помощи иммерсионной системы светового микроскопа. По результатам окрашивания грамположительные микроорганизмы окрасятся в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные в розово-малиновый. Внимание! Приготовленный и окрашенный препарат продемонстрируйте преподавателю! (5 баллов).
4. Зарисовать увиденные в поле зрения микроскопа объекты в отведенное для этого поле справа на бланке работы (3 балла).
5. Сравнить полученный рисунок с изображениями основных форм бактерий (см. приложение 1). Определить родовую принадлежность исследованного микроорганизма и предположить его видовое название (2 балла).
|
|
|
