Стабилизирующая среда для хранения и транспортирования материала для исследований методом ОТ-ПЦР

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 

Организация и проведение

лабораторной диагностики лихорадки денге

 

Методические рекомендации
МР 4.2.0108—16

 

 

    Организация и проведение лабораторной диагностики лихорадки денге: Методические рекомендации.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016.— 20 с.

 

 

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А. Ю. Попова, Е. Б. Еж­лова, Ю. В. Демина, Н. В. Шеенков); ФБУН ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (В. А. Терновой, О. В. Пьянков, И. В. Плясунова, А. П. Агафонов, В. Н. Михеев); ФКУЗ «Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора (Т. Ю. Красовская, С. А. Щербакова, И. Н. Ша­рова, В. В. Кутырев); ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России, подразделение «Институт вирусологии им. Д. И. Иванов­ского (А. М. Бутенко, В. Ф. Ларичев); ГБУЗ «Инфекционная клиническая больница № 1» ДЗМ г. Москвы (Н. А. Малышев, М. А. Сайфуллин).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 1 февраля 2016 г.

3. Введены впервые.

 

 

                                                             © Роспотребнадзор, 2016

      © Федеральный центр гигиены и
эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016

Список сокращений

 

ДНК     дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА     иммуноферментный анализ

НБМ    новорождённые белые мыши

ОТ-ПЦР обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

РН        реакция нейтрализации

РНК     рибонуклеиновая кислота

РСК      реакция связывания комплемента

РТГА   реакция торможения гемагглютинации

Содержание

 

1. Область применения. 5

2. Нормативные ссылки. 5

3. Общие положения. 6

4. Методы лабораторной диагностики лихорадки денге. 8

5. Правила забора, упаковки и транспортирования клинического (или секционного) материала, порядок проведения исследований и координация деятельности учреждений, осуществляющих диагностику заболеваний, вызванных вирусом денге 11

Приложение 1. Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики лихорадки денге. 13

Приложение 2. Оптимальные сроки детекции вируса денге и его маркеров
 в клиническом материале. 16

Приложение 3. Стабилизирующие транспортные среды.. 17

Приложение 4. Тест-системы и наборы реагентов для диагностики
лихорадки денге. 18

Приложение 5. Генотипирование вируса денге. 19

 

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

1 февраля 2016 г.

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 

Организация и проведение
лабораторной диагностики лихорадки денге

 

Методические рекомендации
МР 4.2.0108—16

1. Область применения

1.1. Методические рекомендации (далее – МР) определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики лихорадки денге (далее – ЛД) и носят рекомендательный характер.

1.2. Настоящие МР предназначены для специалистов лабораторий, осуществляющих диагностические, мониторинговые и научные исследования с возбудителями опасных инфекционных болезней.

2. Нормативные ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпиде­миологическом благополучии населения».

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 № 569 «О положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации».

3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.11.2013 № 64 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118—13 «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)» (зарегистрировано в Минюсте России 19.05.2014, регистрационный номер 32325).

4. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.04.2003 № 85 «О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318—03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I—IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированны­ми микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами» (зарегистрировано в Минюсте России 19.05.2003, регистрационный номер 4558).

5. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.05.2007 № 27 «О реализации Международных медико-санитарных правил (2005)» (зарегистрировано в Минюсте России 31.05.2007, регистрационный номер 9575).

6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 04.02.2016 № 11 «О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях санитарно-эпидемиологи­ческого характера» (зарегистрировано в Минюсте России 24.03.2016, регистрационный номер 41525).

3. Общие положения

Лихорадка денге относится к острым природно-очаговым арбовирусным инфекционным заболеваниям с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя, характеризующимся лихорадкой, общей интоксикацией, миалгией, артралгией, лимфоаденопатией, экзантемой, иногда геморрагическим синдромом.

Возбудитель ЛД – вирус денге (Dengue virus), входящий в семейство Flaviviridae, род Flavivirus, серогруппу вируса денге (Dengue virus group), относится ко II группе патогенности (опасности) по классификации патогенности, действующей на территории Российской Федерации. Существует 4 субтипа вируса денге, различающихся серологически и ге­нетически. Все четыре разновидности вируса денге способны вызвать ЛД, в том числе ее геморрагическую форму. Как правило, эта тяжелая форма возникает при повторном инфицировании другим субтипом вируса.

Ареал ЛД охватывает территории более чем 100 тропических и субтропических стран Африки, Америки, Южной и Юго-Восточной Азии, Океании и Австралии. Имеется информация об эпидемиях и вспышках этого заболевания в южных регионах Европы. В Российской Федерации существует вероятность формирования аутохтонных очагов ЛД на территории Черноморского побережья (Сочи и Сочинский район, Крым).

В последнее время в связи с развитием массового туризма, интенсификацией миграционных процессов и деловых связей возникла проблема завозных случаев этих заболеваний из тропических и субтропических стран в неэндемичные районы. Известны данные об импортированных случаях ЛД в Швеции, Финляндии, других европейских странах, в США, лихорадки Чикунгунья в Японии, Германии, Италии и других государствах Европы, Китае, Израиле, москитной лихорадки Тоскана (эндемичной в Средиземноморском регионе) в США, Германии и Швеции. Имеется информация о завозных случаях других арбовирусных инфекций. В течение шести лет (2009—2014 гг.) сотрудниками Инфекционной больницы № 1 г. Москвы и НИИ вирусологии им. Д. И. Ива­новского Минздрава России было диагностировано в общей сложности 178 лабораторно верифицированных случаев: лихорадки денге (152), лихорадки Чикунгунья (16), лихорадки Западного Нила (6), москитных лихорадок (3) и японского энцефалита (1) среди лиц, госпитализированных после возвращения из поездок в тропические страны.

По данным Роспотребнадзора в Российской Федерации наблюдалась следующая динамика регистрации завозных случаев ЛД: в 2012 г. – 63, в 2013 г. – 170, за 8 месяцев 2014 г. – 77, за 10 месяцев 2015 года – 100.

В эндемичных странах мира ежегодно регистрируются до 100 млн случаев ЛД в классической форме и примерно 500 000 в виде геморрагической лихорадки, летальность при которой достигает 15—20 %. Источником инфекции являются больные люди, обезьяны, возможно летучие мыши. Известны 2 эпидемиологические формы ЛД: джунглевая и городская. Переносчиками вируса при джунглевой форме являются комары Aedes niveus (нападающие как на обезьян, так и на людей), при городской эпидемиологической форме лихорадки – синантропные комары преимущественно Aedes aegypti и Aedes albopictus. Вирус способен размножаться в комарах при температуре воздуха не ниже 22 °C.

Вирусный геном представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной около 11 тыс. нуклеотидов. РНК кодирует три структурных (C, prM/M, Е) и семь неструктурных (NS1, NS2А, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) белков.

Основным иммуногенным белком вириона является белок Е, который играет доминирующую роль в генерации нейтрализующих антител и индукции иммунного ответа. На поверхности инфицированных клеток экспрессируется неструктурный гликопротеин NS1, который может секретироваться, инициирует активацию системы комплемента и играет важную роль в развитии шока при геморрагической ЛД.

Инкубационный период ЛД составляет от 2 до 15 дней после укуса инфицированного комара (чаще 5—7 дней), после чего развивается лихорадка, продолжающаяся 6—7 дней и иногда носящая двухфазный характер. Заболевание начинается внезапно с повышения температуры до 39—40 °С, появления озноба, болей в костях и мышцах поясничного отдела позвоночника, прямых мышцах живота, крестце, коленных суставах. Отмечается резкая слабость, головная боль, боли в глазных яблоках, светобоязнь, головокружение, потеря аппетита, возможна тошнота и рвота, бессонница, ощущение сухости во рту и сухости губ. У большинства больных увеличиваются периферические лимфатические узлы. Часто появляется экзантема, для которой характерен полиморфизм. Могут быть геморрагические проявления различной степени выраженности (от петехий до органных кровотечений). Лихорадка продолжается 2—7 дней, иногда она носит двухфазный характер и, как правило, закачивается выздоровлением. Заболевание сопровождается ретроорбитальными болями, миалгией и артралгией. Отмечается покраснение кожи лица и груди с выраженной дерматографией. Примерно в 50 % случаев регистрируется макулопапулезная сыпь. В крови регистрируется лейкопения и тромбоцитопения, повышение уровня трансаминаз. По клиническому течению различают 2 формы ЛД: лихорадочную форму (классическую) и геморрагическую (протекает более тяжело, возможно развитие шокового состояния). В Международной классификации болезней 10-го пересмотра классическая ЛД имеет код А90, геморрагическая ЛД – А91.

Особенностью иммунопатогенеза геморрагической ЛД является то, что специфические антитела могут опосредовать феномен антителозависимого усиления инфекции. Антителозависимое усиление включает повышение связывания вируса с клетками, экспрессирующими рецепторы к Fc фрагментам иммуноглобулинов, после опсонизации антителами. Этот механизм может способствовать утяжелению течения заболевания, часто наблюдаемому при повторном инфицировании гетерологичным вирусом денге.

При геморрагической ЛД летальность достигает 5 %, а среди детей – до 15—20 %. ЛД является ведущей причиной госпитализации и смерти детей в Юго-Восточной Азии.

У реконвалесцентов, перенесших ЛД, типоспецифический иммунитет сохраняется в течение примерно 2 лет. Перекрестная устойчивость к инфицированию другим типом вируса непродолжительна и редко превышает 12 недель, поэтому уже через 2—3 месяца возможно повторное заболевание за счет заражения гетерологичным типом вируса. В течение жизни человек может последовательно переболеть ЛД, вызванной всеми типами вируса.

4. Методы лабораторной диагностики лихорадки денге

4.1. Для специфической диагностики ЛД используют иммунологические, молекулярно-генетические и вирусологические методы исследований.

4.2. С начала клинических проявлений и до 7 дня болезни вирус денге может быть обнаружен методом ОТ-ПЦР в сгустке крови, цельной крови, сыворотке крови, плазме, а также в аутопсийном материале (печень, легкие, лимфатические узлы, тимус, красный костный мозг). Список коммерческих наборов для проведения ОТ-ПЦР приведен в
прилож. 4. При получении положительного результата ОТ-ПЦР проводят определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента к ДНК методом секвенирования.

4.3. Для выделения вируса денге используют новорождённых белых мышей и культуры клеток (Vero, ВНК-21),а также комариные культуры, например, С6/36. Процесс выделения и идентификации вируса денге довольно длительный и проводится в специализированных лабораториях с высоким уровнем защиты (BSL-3). Для выделения вируса используют пробы крови, сыворотки крови, плазмы, обогащенной лейкоцитами, полученные в острый период заболевания (первые 7—10 дней болезни), суспензии органов, взятых при аутопсии.

4.4. Основным методом серодиагностики ЛД является иммуноферментный анализ (ИФА-IgM). Специфические антитела класса IgM выявляются у 50 % пациентов, начиная с 3—5 суток после начала заболевания, а к 10 дню уже у 99 %. Максимальные титры IgM наблюдаются через 2 недели после появления симптомов, постепенное снижение происходит в последующие 2—3 месяца. Возможна циркуляция IgM-антител в крови до полугода. Помимо ИФА-IgM антитела к вирусам денге можно выявлять в сыворотке или плазме больных непрямым методом МФА и методом иммунохроматографии (в сыворотке, плазме или цельной крови). Иммуноглобулины класса G (IgG) в низких титрах обычно обнаруживаются к концу первой недели заболевания, значительно нарастают в последующий период и, вероятно, персистируют в течение всей жизни. Для выявления сероконверсии IgG вторая проба сыворотки обследуется с интервалом в 10—14 дней. Пик IgG антител приходится на 3—4 неделю заболевания, затем их концентрация снижается и остается, как правило, на определяемом уровне в течение длительного времени.

При вторичном инфицировании гетерологичным вирусом денге титры антител нарастают быстрее в основном за счет иммуноглобулинов класса G. Титр IgM во время инфекции, вызванной гетерологичным типом вируса, значительно ниже, чем при первой встрече с возбудителем. Обнаружение IgG-антител имеет значение при ретроспективной диагностике заболевания и дифференциации первичной и вторичной инфекции, вызванной вирусами денге разных типов. Количественное определение IgM и IgG к вирусу денге позволяет определить первичное или вторичное инфицирование, что особенно важно для прогноза исхода заболевания.

4.5. Белок NS1 (NS1-антиген) вируса денге детектируют методом ИФА (в сыворотке крови пациентов и в аутопсийном материале) и методом иммунохроматографии (в сыворотке, плазме, цельной крови) в течение примерно 10 дней с момента появления клинических признаков заболевания, что объясняется высокой концентрацией и продолжительной персистенцией вируса в крови, достигающей 10⁶—10⁸ инфекционных вирусных частиц на мл. Обнаружение NS1-антигена указывает на присутствие вируса денге в организме больного.

4.6. Другие серологические методы диагностики ЛД, такие как реакция нейтрализации (РН), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК) в настоящее время используются редко. РН хотя и обладает высокой специфичностью (при ее использовании возможна идентификация серотипа вируса денге и дифференциация от других флавивирусных инфекций), однако является трудоемким неэкспрессным методом и может использоваться лишь в специализированной вирусологической лаборатории. РТГА также достаточно специфична, но, как и РСК, обладает низкой чувствительностью. РСК эффективна на поздних этапах заболевания, однако при ее использовании, как и в случае применения ИФА и МФА, возникают сложности по дифференциации ЛД от других родственных флавивирусных инфекций.

4.7. В настоящее время в Российской Федерации для серологической диагностики ЛД используются ИФА- и ПЦР-тест-системы. Перечень наборов реагентов и тест-систем для использования при лабораторной диагностике ЛД приведен в прилож. 4. Импортные наборы для выявления NS1-антигена вируса денге и антител классов IgM и IgG на основе метода иммунохроматографии могут быть скомбинированы в один тест, что удобно в использовании. Однако зарубежные тест-системы для постановки ИФА, МФА и иммунохроматографии пока не нашли применения в диагностических лабораториях России.

4.8. Для постановки точного дифференциального диагноза ЛД серологическое обследование крови больных с подозрением на эту инфекцию необходимо проводить наиболее специфичным методом ИФА-IgM в четырех тест-системах: ИФА-IgM-денге, ИФА-IgM-лихорадка Западного Нила (ЗН), ИФА-IgM-желтая лихорадка (ЖЛ), ИФА-IgM-японский энцефалит (ЯЭ). Эти заболевания имеют часто сходные ареалы распространения, этиологически связаны с родственными флавивирусами, перекрестно реагирующими в серологических реакциях. Кроме того, ЛД целесообразно дифференцировать от близкой по клинической картине лихорадки Чикунгунья, распространенной как и ЛД в Африке, Южной Азии, а в последнее время – в Южной Америке и Европе.

4.9. Лабораторное подтверждение диагноза ЛД основывается на наличии как минимум одного положительного результата на следующие тесты:

· обнаружение РНК вирусов денге методом ОТ-ПЦР;

· наличие NS1-антигена в одном образце сыворотки;

· наличие IgM в одном образце сыворотки;

· нарастание титра IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом 2—3 недели, в четыре раза и более.

4.10. Первичное исследование материала от больного осуществляют методами ОТ-ПЦР, ИФА, иммунохимии и иммунохроматографии на базе вирусологических лабораторий, лабораторий особо опасных инфекций в субъектах Российской Федерации, а также, при необходимости, в региональных центрах по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II—IV групп патогенности, в референс-лабораториях.

4.11. В соответствии с приказом Роспотребнадзора от 17.03.2008 № 88 при выявлении положительных результатов первичного обследования пациентов с геморрагическим синдромом, в том числе случаев с летальным исходом, полученный материал отправляется на подтверждающее тестирование в один из Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I—II групп патогенности с прикрепленными субъектами Российской Федерации и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, созданных на базе противочумных учреждений или Национальный центр верификации диагностической деятельности, выполняющий функции Государственной коллекции – ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»*.

5. Правила забора, упаковки и транспортирования клинического (или секционного) материала, порядок проведения исследований и координация деятельности учреждений, осуществляющих диагностику заболеваний, вызванных вирусом денге

5.1. Забор, упаковку и транспортирование материала от пациентов (или умерших) с подозрением на инфекцию, вызванную вирусом денге, осуществляют в строгом соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118—13 «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)», санитарных правил СП 1.2.036—95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности» и методических указаний МУ 3.4.2552—09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологичес­кого благополучия населения».

Забор, упаковку проводят в медицинских организациях. Забор материала от больных производится медицинскими работниками стационара, в который госпитализирован больной, под руководством специалиста Роспотребнадзора, подготовленного по вопросам диагностики особо опасных инфекционных болезней и биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на заражение возбудителями инфекционных болезней I—II групп патогенности. В случае невозможности быстрого прибытия указанных специалистов забор материала от больного осуществляют два медицинских работника, один из которых должен быть подготовлен по биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на заражение возбудителями инфекционных болезней I—II групп патогенности.

Секционный материал отбирают медицинские работники патологоанатомических отделений (бюро судебно-медицинской экспертизы) в присутствии специалиста по особо опасным инфекциям. Забор материала производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры стерильными инструментами. Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики ЛД приведены в прилож. 1.

5.2. При подозрении на ЛД от больных для исследования берут кровь. Для серологических исследований, основанных на выявлении нарастания титра антител в парных сыворотках, образцы крови забирают в острую стадию заболевания, а затем через 2—3 недели. В случае летального исхода исследуют секционный материал (кровь из сердца, кусочки печени, селезенки, легких, лимфатических узлов, тимуса, красного костного мозга).

5.3. Оптимальные сроки детекции вируса денге и его маркеров в клиническом материале представлены в прилож. 2.

5.4. Отправку секционного материала в лабораторию рекомендуется осуществлять в транспортной таре со стабилизирующей средой
(прилож. 3).

5.5. Первичное исследование материала от больного осуществляют методами ОТ-ПЦР, ИФА, НРИФ, иммунохроматографическим методом, а также выделяя вирус на чувствительной биологической модели (при наличии разрешения на проведение работ с вирусом денге). В случае получения положительного результата ОТ-ПЦР, при наличии соответствующего оснащения лаборатории, проводят определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента к ДНК методом секвенирования. Для секвенирования фрагментов генома и генотипирования вируса денге возможно использование протокола, приведенного в прилож. 5.

5.6. Используемые на этапах первичного исследования материала от больного тест-системы и наборы реагентов должны быть разрешены к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

5.7. Результаты исследований направляют в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации и в учреждение, направившее материал.

Приложение 1

Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики лихорадки денге

Цельная кровь