 |
Седиментация макромолекул
|
|
|
|
СЕДИМЕНТАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
Исследование молекулярной массы и формы макромолекул
МГТУ МИРЭА
(Факультет ИТ)
Кафедра «Прикладная синергетика»
2012 г.
ВВЕДЕНИЕ
Методические указания по выполнению практических
заданий (общие положения).
Данная работа выполняется в соответствии с учебным планом по дисциплине «Биофизика». Её цель – познакомить студентов с одним из экспериментальных методов исследования свойств биологических макромолекул, надмолекулярных и субклеточных структур; с принципом действия и устройством экспериментальных установок; особенностями методик проведения экспериментов и экспериментальными возможностями данного метода.
Выполнению работы должно предшествовать изучение теоретического материала (лекции и литературные источники). Описание практического задания также содержит некоторые основные теоретические положения, лежащие в основе экспериментального метода. Задание может считаться успешно выполненным, если получены правильные ответы на контрольные вопросы и отдельные задания; приведены обоснования этих ответов со ссылками на соответствующие теоретические положения.
По выполненному заданию необходимо представить отчет, который должен содержать:
- название работы;
- цель работы
- ответы на вопросы (отдельные задания) с теоретическим обоснованием;
- необходимые расчеты и графические иллюстрации;
- дополнительные сведения и соображения по теме практической работы (по желанию студента).
СЕДИМЕНТАЦИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ
В настоящее время одним из наиболее распространенных методов для определения характеристик макромолекул является метод седиментации. Седиментация- это осаждение частиц в жидкости под действием силы тяжести.
|
|
|
Рассмотрим на небольшом примере, возможна ли реальная седиментация в поле силы тяжести для макромолекул с молекулярной массой 105. Энергия гравитации для такой макромолекулы между двумя точками в пробирке,
отстоящими на расстоянии 10–2 м, составляет Е=mgh. Если m = 105 / 6×1026 = 0,16 ×10 -21 кг, то Е = 0,16×10 -21×10× 10 –2 = 1,6 × 10 -23 Дж. Величина тепловой энергии составит
k 
T=1,38 × 10 –23 × 2,9310 2= 4 × 10 -21 Дж.
Видно, что тепловая энергия почти в 200 раз больше гравитационной энергии. Таким образом, для макромолекул сила гравитации настолько мала, что действие случайных соударений с молекулами растворителя значительно превышает седиментацию макромолекул.
Возникшее затруднение можно преодолеть, увеличив потенциальную энергию до величин, превышающих k T. Это можно сделать в ультрацентрифуге. За счет больших центробежных ускорений, превышающих g в 10 4 – 10 5 раз, создаются центробежные силы, в результате которых легко происходит седиментация как 350000 g, указывают, во сколько раз ускорение в центрифуге превышает ускорение земного тяготения. Для создания таких фантастических ускорений необходимы ультрацентрифуги, в которых ротор совершает 60 - 70 тыс. оборотов в минуту.
С помощью оптических систем определяется скорость седиментации макромолекул v = dx/dt. На рис. 1 схематически показано смещение границы и пика седиментации. Измерив положение ширен пика в зависимости от времени седиментации, легко определить скорость седиментации макромолекул в ячейке.
3. МЕТОД СКОРОСТИ СЕДИМЕНТАЦИИ
Метод используется преимущественно для определения молекулярных масс макромолекул с небольшим коэффициентом поступательной диффузии, когда седиментация значительно преобладает над диффузией. Рассмотрим состояние макромолекулы в ячейке (рис.1). Через определенное время макромолекулы седиментируют равномерно и с одинаковой скоростью седиментации v. Это связано с тем, что силы, действующие на макромолекулу, уравновешиваются:
|
|
|
F 
=Fв +Fс. (1)
Центробежная сила:
F = mw2x = 4/3 ×p r3rw2 x, (2)
где m - масса макромолекулы; r - радиус макромолекулы; p - плотность макромолекулы; x - расстояние от оси вращения ротора.
Угловая скорость:
w = p n/30 [c-1], (3)
где n – скорость вращения ротора, об/мин.
Выталкивающая сила:
Fв = m0 w2 x = 4/3 ×p r3r0 w2 x, (4)
где m0 – масса вытолкнутой жидкости; pо -плотность растворителя.
Разделим (2) на (4):
F /Fв = r /r0; Fв = F × r0 /r. (5)
Сила сопротивления:
Fc = f v, (6)
где f - коэффициент внутреннего трения. Запишем (6) как F - Fв = Fс и выразим Fв через F , как в (3.33):
F - F (r0 /r) = f v и
F (1 – r /r 0 ) = f v. (7)
Подставив (2) для центробежной силы в (7), получим:
m(1- r /r0)w 2 x = fv. (8)
Отсюда масса макромолекул запишется так:
m = (1/ (1- r /r0 ) (v/w2x). (9)
Вводится новая важная характеристика – коэффициент седиментации s - отношение скорости седиментации v к угловому ускорению w2x:
s = v/w2x = dx/dt × 1/w2 x = 1/w 2 × d(ln x)/dt. (10)
Размерность коэффициента седиментации – [с]. За единицу седиментации принят 1 (С) – 10-13с.
Вводится парциальный удельный объем:
W = 1/r [ л/кг ]. (11)
Он определяется как возрастание объема растворителя при растворении 1 кг сухого вещества в фиксированном объеме растворителя. Если подставить W и заменить f через коэффициент диффузии D, получим массу макромолекулы:
m = k0 Ts / D (1- r0 W). (12)
Молекулярная масса макромолекулы запишется как:
M = RTs / D (1- r0 W). (13)
 |
Рис.1. Седиментация макромолекул в кювете: а - положение границы седиментации в кювете; (время седиментации t0,t1,t2,t3); б - изменение концентрации с макромолекул вдоль кюветы; в – перемещение шлирен- пика при седиментации макромолекул.
 |
Рис. 2. Действие сил на макромолекулу при центрифугировании:
|
|
|
