 |
Система детоксикации цитохрома Р450 и его представители
|
|
|
|
ДИПЛОМНАЯ РАБОТА
РАСПРОСТРАНЕНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПОЛИМОРФИЗМА C1/C2 В ГЕНЕ CYP2E1
Автор дипломной работы
Обозначение дипломной работы
Специальность 020201.65 Биология
Руководитель работы
д-р биол. наук, проф.
Нормоконтролер
канд. биол. наук, доц.
Рецензент
канд. биол. наук, доц.
Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального образования
Факультет биотехнологии и биологии
Кафедра генетики
УТВЕРЖДАЮ
2015 г.
ЗАДАНИЕ НА ДИПЛОМНУЮ РАБОТУ
Студент
1. Тема Исследование полиморфизма С1/С2 гена CYP2E1 жителей республики Мордовия.
Утверждена по МордГу
2. Срок представления работы к защите: 26.06.15 г.
3. Исходные данные для дипломной работы: научные журналы по профилю, научная и учебная литература, интернет источники, опыты
4. Содержание дипломной работы
4.1 Обзор литературы
4.2 Материалы и методы исследования
4.3 Результаты и обсуждение
5. Приложения: 1
Руководитель работы
Задание принял к исполнению
РЕФЕРАТ
Дипломная работа содержит 43 страницы, 7 таблиц, 5 рисунков, использованных источников.
ГЕН, ПОЛИМОРФИЗМ, МУТАЦИЯ, CYP2E1, полиморфизм с1/с2, ДНК
Материалом исследования послужила цельная венозная кровь человека от здоровых людей и больных страдающих алкоголизмом.
Цель работы – изучение распространения и молекулярная диагностика полиморфизма С 1/С2 гена CYP2E1.
Методы исследования: выделение ДНК из крови с использованием протеиназы K, ПЦР-анализ, электрофорез в агарозном геле, детекция и анализ результатов электрофоретического разделения с помощью программ Gel Explorer: Gel Imager, Gel Analysis.
Степень внедрения – частичная.
|
|
|
Область применения – в молекулярной биологии и медицинской генетике.
Эффективность – внедрение в работу НОЦ «ДНК-диагностики и геномных исследований».
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 6
1 Обзор литературы 7
1.1 Система детоксикации цитохрома Р450 и его представители 7
1.2 Ген CYP2E1, строение и локализация 9
1.2.1 Полиморфные варианты и мутации гена CYP2E1 12
1.3 Популяционно-генетические исследования полиморфизмов
в гене CYP2E1 13
1.4 Прикладное значение исследований полиморфизмов
гена CYP2E1 19
1.5 Гены и их белковые продукты участвующие
в развитии алкоголизма 20
2 Материалы и методы 23
2.1 Объект исследования 23
2.2 Методы исследования 23
2.2.1 Выделение ДНК с использованием протеиназы К 23
2.2.2 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 24
2.2.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле 26
2.2.3.1 Приготовление агарозного геля 27
2.3 Статистическая обработка результатов анализа 27
3 Результаты и их обсуждение 29
ВЫВОДЫ 32
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 33
ПРИЛОЖЕНИЕ А 40
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
ЭПС - эндоплазматической сети
ГАМК - гамма-аминомасляной кислоты
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ПАВ – психоактивные вещества
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ГБ – гипертоническая болезнь
АБП – алкогольная болезнь печени
ОШ – отношение шансов
ДИ – доверительный интервал
ЭЭГ – электроэнцефалография
ВВЕДЕНИЕ
Профессор Кирка Вилгельмсен с сотрудниками из Университета Северной Каролины провели серию экспериментов и сделали вывод, что реакцию организма на алкоголь определяет расположенный в конце 10-й хромосомы ген CYP2E1.
Однако влияние продуктов данного гена на физиологические процессы гораздо шире и определяется различными полиморфными вариантами.
Вариант T полиморфизма RsaI (RsaI c2) способствует повышенной транскрипционной активностью и связан с алкогольной болезнью печени в то время как вариант С полиморфизма PstI (PstI+) соответсвует повышенному риску развития онкологических заболеваний. Вариант C полиморфизма DraI тоже является онкологическим маркером. В европейский популяциях, частоты встречаемости вариантов RsaI c2 и PstI+ составляют 1–3%, встречаемость варианта DraI около 10%. Также риск развития онкологического процесса у людей имеющих данный полиморфизм повышается при употребление соленой пищи и курении, даже в небольшом количестве.
|
|
|
В связи с этим целью нашей работы является изучение основных полиморфизмов гена CYP2E1 у жителей республики Мордовия.
В этой связи нами были поставлены следующие задачи:
Дать структурно-функциональную характеристику гену CYP2E1.
2 Изучить основные полиморфные варианты и мутации в исследуемом гене.
Провести анализ данных по частоте встречаемости полиморфизма с1/c2 гена CYP2E1 у жителей республики Мордовии.
Обзор литературы
Система детоксикации цитохрома Р450 и его представители
Печень связывает и обезвреживает токсичные вещества с помощью ферментов. Этот процессобычно происходит в два этапа: фаза I и фаза II. На первом этапе отходы и ядовитые вещества химически преображаются, а на втором этапе ферменты печени окончательно обезвреживают их. На первой фазе в детоксикации участвует группа ферментов цитохром Р450. В метаболизме ксенобиотиков участвуют около 30 ферментов. В нем различают две фазы: 1) модификация, создающая или освобождающая функциональные группы, 2) конъюгация - присоединение к последним других групп или молекул. Обычно метаболизм происходит именно в такой последовательности, но при наличии в молекуле ксенобиотика функциональных групп он может сразу же подвернуться конъюгации. Как правило обе фазы, особенно при совместном действии, приводят к увеличению гидрофильности и снижению активности и токсичности молекулы [1-5]. Третьей фазой - уже не метаболизма, а судьбы ксенобиотиков - можно считать связывание и выведение самих ксенобиотиков и их метаболитов из клетки, а затем из организма [55].
В первой фазе наиболее важной является локализованная в основном в мембранах ЭПС система цитохрома Р-450, называемая также микросомальной системой метаболизма или монооксигеназной системой [1, 2, 4, 5]. Основные функции которой – образование в молекуле гидрофильных функциональных групп с детоксикацией десятков тысяч веществ. Важными достоинствами системы являются локализация и высокая мощность на главных путях поступления ксенобиотиков в организм - пищевом (печень и желудочно-кишечный тракт) и дыхательном (легкие) - и многообразие путей метаболизма: гидроксилирование (бензол, фенол, полициклические ароматические углеводороды - ПАУ, барбитураты), эпоксидирование (ПАУ), окисление по сере (аминазин) и азоту (аминазин, никотин), восстановление нитро- (нитробензол, левомицетин) и азогрупп (сульфасалазин), деалкилирование по азоту (морфин, амидопирин), кислороду (кофеин, колхицин) и сере (6-метилтиопурин) и десульфурация (паратион, тиобарбитал). Транспорт атомов водорода и электронов в ЭПС печени при гидроксилировании субстрата (это самый частый и важный случай) происходит следующим образом:
|
|
|
НАДФН-зависимая цепь является ведущей, особенно для гидроксилирования: в ней выше скорость реакций и строго доказано биологическое значение. Указанные реакции превращают, например, фенол в менее опасный пирокатехин:
С6Н5ОН + НАДФН + Н+ + О2
С6Н4(ОН)2 + НАДФ+ + Н2O
Однако этой системе присущи и серьезные ограничения и даже недостатки: 1) слабость или отсутствие во многих жизненно важных органах (сердце, головной мозг), 2) меньшая защита организма при других путях проникновения (слизистые, раны, инъекции), 3) токсификация некоторых веществ. Так, система цитохрома Р-450 превращает хлороформ, хорошее средство для общего наркоза, в боевое отравляющее вещество фосген (СHCl3 Cl2C=O), что объясняет высокую токсичность хлороформа [45,37]. Популярное обезболивающее и жаропонижающее лекарство парацетамол превращается в метаболит, в больших дозах повреждающий печень и почки, - нужна осторожность в применении при заболеваниях этих органов. ПАУ бенз(а)пирен превращается в канцерогенный (вызывающий рак) метаболит дигидроксиэпоксид, следовательно, бенз(а)пирен только проканцероген, а истинным канцерогеном он становится после токсификации системой цитохрома Р-450[12].
|
|
|
Основные функции второй фазы те же, что и первой: увеличение гидрофильности и снижение токсичности ксенобиотиков. Наиболее важные ферменты второй фазы относятся к классу трансфераз[22]. Наиболее широка и многообразна активность семейства глутатионтрансфераз, метаболизирующих тысячи ксенобиотиков. Большинство этих ферментов находится в гиалоплазме, но один из них локализован в мембранах ЭПС и митохондрий, другой - в хроматине.
Ко второй фазе относят и некоторые другие ферменты. Эпоксидгидролаза (эпоксидгидратаза) присоединяет воду к эпоксидам (бензола, бенз(а)пирена и др.), что превращает их в диолы [4]:
Функционирование всех ферментов второй фазы ограничивается тем, что они метаболизируют только те вещества, которые имеют функциональные группы. Именно поэтому эти ферменты чаще включаются после образования или освобождения функциональных групп ферментами первой фазы, то есть во второй фазе метаболизма ксенобиотиков [25,35,43]. Однако трансферазы имеют важные достоинства: 1) они есть во всех клетках, поэтому: 2) функционируют при любых путях поступления ксенобиотиков в организм, 3) осуществляют или завершают детоксикацию, а иногда исправляют ошибки первой фазы. Так, они обезвреживают токсичные метаболиты ПАУ (канцерогены), хлороформа (фосген), парацетамола. Правда, теперь обнаружено, что и эти ферменты могут токсифицировать некоторые ксенобиотики, но это встречается реже, чем для системы цитохрома Р-450 [3, 5-8].
|
|
|
