 |
Ферментные свойства возбудителей
|
|
|
|
РАЗДЕЛ 2: частная микробиология
ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ:
обучающие:
| · дать понятие о правилах забора, хранения, транспортировки и подготовки материала к |
| исследованию; |
|
| · обучить методике микробиологической диагностики дифтерии |
ЗАДАНИЯ.
| 1. Произвести посев материала из зева и носа на питательные среды. |
| 2. Изучить морфологий колоний на плотных питательных средах с помощью стереомикроскопа. |
| 3. Произвести посев культуры на агар с 25% сывороткой для выделения чистой культуры и на столбик со средой Пизу для определения фермента цистиназы. |
| 4. Приготовить мазки из культуры, выросшей на среде с сывороткой и окрасить их метиленовым синим, результаты микроскопирования зарисовать. |
| 5. Поставить пробу на токсигенность на среде ОТДМ. |
| 6. Произвести учет ферментативного ряда. |
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.
1. Какие биовары коринебактерий Вы знаете, по каким признакам они выделяются?
2. Каковы культуральные особенности возбудителя дифтерии?
3. Как осуществляется доставка исследуемого материала в лабораторию?
4. Каким методом определяют токсигенность культуры коринебактерий дифтерии?
ТЕМА: «МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ДИФТЕРИИ»
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: выделение возбудителя дифтерии и оределение его токсигенности
Возбудитель – Corynebacterium diphtheriae: биовары gravis, mitis, intermedius
(род Corynebacterium семейства Corynebacteriaceae)
Материал для исследования:
1. отделяемое слизистой оболочки зева;
2. отделяемое слизистой оболочки носа;
3. отделяемое слизистой оболочки глаза;
4. гной из уха;
|
|
|
5. отделяемое слизистой оболочки влагалища;
6. отделяемое раны;
Способы сбора материала
Для взятия материала используют стерильные ватные тампоны. Материал из зева (с миндалин) и носа берут отдельными тампонами натощак либо не ранее, чем через 2 часа после еды, до лечебных процедур, при хорошем освещении при помощи шпателя и не касаясь тампоном языка, слизистой щек и зубов.
Для взятия материала из носа используют тампон, который вводят поочередно в оба носовые хода, не касаясь крыльев носа снаружи.
Слизь из глаза, гной из уха, отделяемое слизистой оболочки с влагалища, отделяемое раны также собирают тампоном.
Транспортировка
При длительной транспортировке используется транспортная среда или тампоны, смоченные до стерилизации 5% р-ром глицерина. Транспортная среда: 0,1% агар разливается в пробирки по 5 мл, стерилизуется в автоклаве при 1200С (1 атм – 20 мин). Перед употреблением в каждую пробирку добавляют 0,5 мл лошадиной сыворотки и по 1 капле 2% р-ра теллурита калия. Срок годности 10 дней.
Доставка материала в лабораторию обеспечивается в течение 2-х часов. В холодное время года тампоны необходимо предохранять от охлаждения, в теплое – от высыхания.
Основные методы исследования:
· Микробиологический
· Бактериоскопический
· Биологический
День исследования
Посев материала на питательные среды
Посев материала производят на чашки Петри с кровяным и с кровяно-теллуритовым агаром, на среды Бучина и Клауберга. Посев материала от одного лица можно производить на одну чашку (1/2 чашки – материал из зева, 1/2 чашки – материал из носа). При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке 1×2 см2, а затем петлей рассевают по всей поверхности отведенного для посева участка. Перед посевом чашки со средами согревают при комнатной температуре или в термостате 15-20 мин. Посевы инкубируют в термостате при температуре 370С.
|
|
|
День исследования.
Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 (48) часов после посева материала с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа (МБС). На среде КТА коринобактерии биовара gravis - в виде крупных, сухих, серо-черных колоний: «маргаритки» - R форма; биовар mitis – в виде мелких, черных колоний
(S форма). На теллуритовых средах дифтерийные палочки образуют темно-серые или черные колонии вследствие восстановления теллурита до металлического теллура. Восстановление происходит внутри бактериальной клетки.
На КА формируются колонии средней величины, выпуклые, серовато-белого цвета.
На среде Бучина колонии имеют синий цвет, а среда в месте их роста приобретают фиолетовый оттенок.
При наличии подозрительных колоний часть их под контролем МБС снимают на агар с 25% сывороткой и на столбик со средой Пизу для определения фермента цистиназы. Из оставшихся частей колоний ставят пробу на токсигенность.
Определение цистиназной активности (проба Пизу).
Производят посев исследуемой культуры в центр столбика среды Пизу. При положительной реакции через 18-24 часа по ходу укола наблюдается почернение. Почернение - результат расщепления ферментом цистиназой цистина, который входит в состав среды. Освободившаяся сера вступает в реакцию с ацетатом свинца с образованием сульфита свинца черного цвета.
Определение токсигенности
Среда для определения токсигенности дифтерийных микробов (ОДТМ) готовят в соответствии с рецептом. Приготовленную среду разливают в пробирки по 10 мл. Непосредственно перед постановкой пробы на токсигеность питательный агар расплавляют на водяной бане при 900С, охлаждают до 500С и добавляют 20% сыворотки крови крупного рогатого скота: к 10 мл среды 2 мл сыворотки. Перемешивают и выливают в стерильные чашки Петри. Количество агара в чашке должно быть не более 12 мл, чтобы сохранить прозрачность среды. После застывания агара накладывают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной противодифтерицной антитоксической сывороткой.
Испытуемую культуру засевают «бляшками» с помощью петли. Диаметр бляшек – 0,8 – 1,0 см. Расстояние бляшек от края полоски бумаги 0,5 – 0,7 см, между двумя бляшками заведомо токсигенного штамма засевают бляшками испытуемой культуры.
|
|
|
Испытуемую культуру считают токсигенной, если линии преципитации четкие и сливаются с линиями преципитации контрольного токсигенного штамма. Если линии преципитации перекрещиваются с линиями контрольно штамма или отсутствуют, выделенную культуру считают нетоксигенной.
День исследования.
Через 24 часа культивирования посевы вынимают из термостата и учитывают результаты. Делают мазки из культуры, выросшей на среде с сывороткой и окрашивают их метиленовым синим.
Наличие в мазках характерных по морфологии палочек, черного с «облачком» стержня в среде Пизу и линий преципитации в агаре дает право выдачи предварительного положительного ответа. Для окончательной идентификации выделенной культуры и определения биовара возбудителя определяют ферментативные свойства: производят посев на глюкозу, сахарозу, крахмал и бульон с мочевиной (для выявления уреазы).
5 день исследования. Учет результатов.
Ферментные свойства возбудителей
| С.diphtheriae биовар gravis | цистиназа | уреаза | глюкоза | сахароза | крахмал | токсигенность |
| + | - | + | - | + | + | |
| биовар mitis | + | - | + | - | - | + |
|
|
|
