Преимущества и недостатки флуориметрии по сравнению со спектрофотометрией.

Применение спектрофотометрии в точной колориметрии.

Основное применение спектрофотометров в лаборатории — точ­ная колориметрия, т. е. измерение количества хромофора, образую­щегося в ходе реакции. Многие соединения, слабо поглощающие в види­мой области, после реакции с другими веществами дают окрашен­ные продукты, количество которых однозначно связано с концен­трацией исходного вещества. Такую цветную реакцию используют для обнаружения этих веществ. При некоторых стандартных усло­виях и определенных концентрациях вещества проводят реакцию, а затем измеряют поглощение смеси. В качестве сравнения исполь­зуют ту же смесь, но без исследуемого вещества. При помощи этого контрольного образца изменением щели устанавливают нулевое значение экстинкции. После ряда измерений строят график зави­симости поглощения образца от концентрации исследуемого вещест­ва. Теперь, когда нужно определить количество вещества, в стан­дартных условиях проводят реакцию, измеряют поглощение образ­ца и по градуировочной кривой определяют концентрацию исход­ного вещества. В биохимии этот способ применяется довольно час­то, поскольку во многих случаях удается подобрать такие реакции, когда незначительные количества вещества дают сильное окраши­вание.При их проведении необходимо помнить следующее.

1. Измерение поглощения следует проводить в дополнительной для цветной реакции области спектра. Так, если при реакции рас­твор окрашивается в желтый цвет, нужно измерять поглощение этим раствором синего света.

2. Исследовать цветную реакцию лучше всего в максимуме по­глощения — этим достигается наибольшая чувствительность. Если положение максимума неизвестно, его следует определить. Такие предосторожности гарантируют получение хороших результатов даже на малочувствительном приборе.

3. В кювете с контрольным раствором обязательно должны содержаться все компоненты, кроме исследуемого вещества.

4. Контрольный раствор должен быть приготовлен очень тща­тельно, поскольку от этого зависит получение правильных резуль­татов.

5. Если зависимость линейна, для получения хорошей градуи- ровочной кривой нужно не менее пяти точек. Для нелинейной кри­вой их нужно существенно больше. Построение градуировочной кривой позволяет исключить точки, поглощение для которых полу­чено ошибочно.

6. Измерение концентрации необходимо проводить дважды, и на кривую наносить оба значения, а не их среднюю величину. Такой способ построения наглядно показывает точность определе­ния концентрации по полученной градуировочной кривой. Кроме того, он позволяет сразу обнаружить неправильные измерения по их сильному отклонению от кривой.

7. Калибровочные кривые, полученные с реагентами разных партий, как правило, не совпадают. Поэтому при смене реагента градуировочную кривую надо получить заново.

8. Наилучшая кривая, проведенная по всем экспериментальным точкам, не обязательно должна точно проходить через нуль. Это связано с тем, что для поглощающего контрольного раствора прак­тически невозможно получить точно такое же соотношение всех компонентов, как для образца.

Спектрофлуориметрия. Природа флуоресцентных спектров. Особенности флуориметра.

Люминесценция- испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний – делится на два типа в зависимости от природы основного и возбужденного состояния. В синглетном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Говорят, что эти электроны спарены. В триплетном состоянии эти электроны не спарены, т.е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из возбужденного сингнетного состояния в основное ориентация его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина необходимо при переходе из триплетного состояния в синглетное основное состояние.

Природа флуоресценсии

Флуоресценция- это испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически “разрешимы”, а типичные величины скоростей испускания для них~10⁸ с^-1. Высокие значения скорости испускания приводят к временам затухания флуоресценции 10⁸ с(10 нс). Время жизни- это средний период времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии. Фосфоресценция- это испускание, происходящее при переходе между состояниями различной мультиплетности, как правило из возбужденного триплетного состояния в синглетное основное. Такие переходы не разрешены, и константы скорости испускания малы. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции — от миллисекунд до секунд, что главным образом зависит от вклада других процессов дезактивации.

Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции - это зависимость интенсивности флуоресценции от длин волн (в нанометрах) или волновых чисел (в см^-1). Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены. Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от химической структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуорофор рас творен. Спектры некоторых соединений, таких, как перилен, имеют четкую структуры, обусловленную отдельными колебательными уровнями энергии основного и возбужденного состояний. Другие состояния, такие, как хинин, имеют спектры без колебательной структуры.

Особенности флуориметра

Состоит: Источник света с широким спектральным диапазоном (ртутка или ксиноновая лампа); монохроматор М1 выделяет свет определенной волны для возбуждения образца; образец; 2-й монохроматор, для определения спектра флуоресценции образца при постоянной длины волны возбуждения; дэтектор, обычно чувствительный фотоэлемент; усилитель; выход.

Для регистрации спектра возбуждения образца, его освещают светом различных длин волн, поворачивая монохроматор М1, измеряют флуоресценцию при постоянной длине волны, М2 не подвижен. Спектр флуоресценции снимают при неподвижной М1, в этом случае образец освещается светом постоянной длины волны. И измеряют флуоресценцию при разных длинах волн, перемешивая М2.

Преимущества и недостатки флуориметрии по сравнению со спектрофотометрией.

Благодаря тому что интенсивность флуоресценции пропорцио­нальна концентрации вещества, во флуориметрах используется сравнительно простая электроника. Спектрофлуориметрические ме­тоды обладают высокой чувствительностью и позволяют работать с крайне малыми концентрациями вещества, когда спектры погло­щения регистрировать очень трудно; по флуоресценции можно об­наружить, например, 0,01 мкг катехоламинов или НАД-Н. Чувст­вительность флуориметров легко менять в широком диапазоне, уси­ливая ток фотоумножителя. Спектрофлуориметры обладают хоро­шей спектральной селективностью, поскольку благодаря стоксо- вому сдвигу можно использовать два монохроматора — один на­строенный на длину волны возбуждающего света, а другой — на длину волны флуоресценции. Во флуориметре не требуется кюве­ты сравнения, но надо иметь калибровочную кривую.

Основная трудность, возникающая при флуориметрическйх изменениях, — это тушение флуоресценции, когда энергия воз­буждения молекул переходит не в световую, а в тепловую энергию их движения.

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: