 |
Методы выявления генных мутаций
|
|
|
|
Сложность выявления генных мутаций связана, во-первых, с рецессивностью большинства мутаций (вероятность их фенотипического проявления ничтожно мала), а во вторых с летальностью многих из них (мутанты не выживают).
Все множество методов выявления генных мутаций можно разделить на две группы: методы генетического анализа и биохимические методы.
1. Методы генетического анализа основаны на скрещивании возможных носителей мутации с тестерными линиями (линиями-анализаторами). Самый простой метод – это скрещивание носителей предполагаемой мутации с соответствующей рецессивно-гомозиготной линией, т.е. обычное анализирующее скрещивание.
Однако этот метод не позволяет выявить неизвестные мутации, а также летальные мутации. Поэтому создаются специальные тестерные линии для учета летальных мутаций.
Например, у мушки дрозофилы синтезирована тестерная линия М –5 (Мёллер–5), которая характеризуется особой структурой X –хромосом у самок. В этих хромосомах имеются аллели с определенным фенотипическим проявлением (доминантный аллель B – полосковидные глаза; рецессивный аллель wa – абрикосовые глаза; кроме того, имеется еще один аллель – sc, контролирующий отсутствие щетинок, но он в анализе обычно не учитывается). В хромосомах М –5 изменен порядок генов: имеется одна большая инверсия и одна малая, расположенная внутри большой (инверсии будут рассмотрены ниже); такое строение хромосом исключает появление кроссоверных особей при скрещивании мушек М –5 с другими линиями.
Для выявления мутаций используются самцы дикого типа – с нормальными X –хромосомами (аллели В + и w + – нормальные красные глаза, sc + – нормальные щетинки; нормальный порядок генов). Эти самцы подвергаются обработке мутагенами (факторами, повышающими частоту мутаций). В результате в их половых клетках часть X –хромосом мутирует, т.е. в них возникают мутации. Обработанные самцы скрещиваются с самками М –5. В первом поколении (F1) все самки имеют полосковидные темно-красные глаза, а самцы – абрикосовые полосковидные глаза. Кроме того, часть самок получает от отцов по нормальный X –хромосоме, а часть – по мутантной X –хромосоме. Все самцы получают от матерей М –5 только немутантные хромосомы с аллелями В и wa. В F1 рецессивные мутации у самок, даже если они есть, не дают летального эффекта, поскольку они находятся в гетерозиготном состоянии: мутантная X –хромосома дикого типа от отца сочетается с немутантной М –5–хромосомой от матери.
|
|
|
Затем гибриды первого поколения скрещиваются между собой, и потомство каждой самки выращивается отдельно. Часть самок несет немутантную X –хромосому дикого типа, и в их потомстве обнаруживаются немутантные самцы дикого типа. Однако некоторая часть самок несет мутантную X –хромосому дикого типа с летальной мутацией; соответственно их сыновья, получившие такие хромосомы, не выживают, и самцы дикого типа в потомстве самок–носительниц не обнаруживаются.
Ниже приведены схемы скрещивания, иллюстрирующие принцип использования метода Мёллер–5 (символом l обозначены летальные мутации).
| Р: | ♀ wa B // wa B | × | ♂ w+ B+ // Y | – обработка самцов |
| абрикосовые полосковидные | красные нормальные | – окраска и форма глаз | ||
| GP: | wa B | w+ B+ | – немутантная X –хромосома | |
| w+ B+ l | – мутантная X –хромосома | |||
| Y | – Y –хромосома |
| F1: | ♀ w+ B+ // wa B | ♀ w+ B+ l // wa B | ♂ wa B // Y |
| красные полосковидные глаза; без летальных мутаций | красные полосковидные глаза; носители летальных мутаций | абрикосовые полосковидные глаза |
|
|
|
1 вариант скрещивания – без летальных мутаций
| F1: | ♀ w+ B+ // wa B | × | ♂ wa B // Y | |||||
| красные полосковидные глаза | Абрикосовые полосковидные глаза | |||||||
| G1: | w+ B+ | wa B | ||||||
| wa B | Y | |||||||
| F2: | ♀ w+ B+ // wa B | ♀ wa B // wa B | ♂ w+ B+ // Y | ♂ wa B // Y | ||||
| Красные полосковидные глаза | абрикосовые полосковидные глаза | красные нормальные глаза | абрикосовые полосковидные глаза | |||||
2 вариант скрещивания – при наличии летальных мутаций
| F1: | ♀ w+ B+ l // wa B | × | ♂ wa B // Y | |
| красные полосковидные глаза | абрикосовые полосковидные глаза | |||
| G1: | w+ B+ l | wa B | ||
| wa B | Y |
| F2: | ♀ w+ B+ l // wa B | ♀ wa B // wa B | ♂ w+ B+ l // Y | ♂ wa B // Y |
| красные полосковидные глаза | абрикосовые полосковидные глаза | самцы не обнаруживаются (летали) | абрикосовые полосковидные глаза |
В настоящее время, кроме тестерной линии М –5 используются и другие тестерные лини мушек дрозофил и других модельных объектов. Например, существуют тест-системы, позволяющие выявлять мутации X -хромосомах самцов в первом же поколении, а также мутации в аутосомах. Применение этих линий позволяет изучать закономерности мутационного процесса, однако классический генетический анализ далеко не всегда можно использовать для выявления мутаций в популяциях человека и многих других организмов.
2. Биохимические методы выявления мутаций исключительно разнообразны и основаны на применении различных методик.
а). Методики, основанные на выявлении определенных биохимических продуктов мутантных генов. Легче всего выявлять мутации по изменению активности ферментов или по утрате какого-либо биохимического признака. Например, у микроорганизмов на селективных питательных средах выявляются ауксотрофные формы, не способные синтезировать определенные вещества (по сравнению с нормальными, прототрофными формами).
б). Методики, основанные на непосредственном выявлении измененных нуклеиновых кислот и белков с помощью гель-электрофореза в сочетании с другими методиками (блот-гибридизации, авторадиографии).
|
|
|
Общие закономерности мутационного процесса. Механизмы возникновения генных мутаций
|
|
|
