 |
Теоретические основы метода
|
|
|
|
Введение
Изотахофорезом называется такой вид электрофореза, при котором все заряженные компоненты движутся в электрическом поле с одинаковыми (изо-) скоростями (тахо-). Принцип изотахофореза был открыт еще Кольраушем в 1897 году, однако как метод разделения он начал распространяться лишь в 70-х годах после того, как были детально исследованы его основы и преимущества. С тех пор он, по-видимому, приобретает все более возрастающее значение в химии и биохимии при разделении ионов как с низкой, так и с высокой молекулярной массой. Нужно отметить, что Орнштейн и Дэвис в разработанном ими дискэлектрофорезе использовали изотахофорез (названный ими steady-state stacking - устойчивое состояние уложенных стопкой полос) для концентрирования белков перед разделением их молекул по размерам и заряду с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
изотахофорез электрический белок ион
Теоретические основы метода
Изотахофорез (ИТФ) - метод разделения различных типов ионов <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%BE%D0%BD> по их подвижности в электрическом поле <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%B5_%D0%BF%D0%BE%D0%BB%D0%B5>. При ИТФ все виды ионов <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%BE%D0%BD> мигрируют в одном направлении, образуя набор зон, находящихся в равновесном состоянии и перемещающимися с одинаковыми скоростями.
В основе метода ИТФ лежит система, состоящая из трех различных электролитов <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D1%82>, объединенных общим противоионом:
· ведущий электролит <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D1%82>, содержащий анионы <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BD%D0%B8%D0%BE%D0%BD> с наиболее высокой электрофоретической <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%BE%D1%84%D0%BE%D1%80%D0%B5%D0%B7> подвижностью, располагается в анодной <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BD%D0%BE%D0%B4> области;
|
|
|
· замыкающий электролит <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D1%82>, содержащий анионы <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BD%D0%B8%D0%BE%D0%BD> с минимальной подвижностью, располагается в одной <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D0%B0%D1%82%D0%BE%D0%B4> области;
· смесь электролитов <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D1%82> анализируемой смеси, содержащая анионы <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BD%D0%B8%D0%BE%D0%BD> с промежуточной подвижностью.
Если через эту систему пропустить электрический ток <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%82%D0%BE%D0%BA>, то анионы <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BD%D0%B8%D0%BE%D0%BD> расположатся последовательно в соответствии с их электрофоретической подвижностью, ведущий в области анода <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BD%D0%BE%D0%B4>, замыкающий в области катода <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D0%B0%D1%82%D0%BE%D0%B4>, остальные между ними в виде узких зон с четкими концентрационными границами. Ширина отдельных зон по завершении процесса соответствует абсолютному количеству в смеси того или ионного аниона <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BD%D0%B8%D0%BE%D0%BD>.
Поскольку отдельные зоны располагаются последовательно. они практически соприкасаются, поэтому в исследуемый образец вносят буфер <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%91%D1%83%D1%84%D0%B5%D1%80>, содержащий анион <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BD%D0%B8%D0%BE%D0%BD> с промежуточной подвижностью, зона которого встроится в полученную последовательность и раздвинет зоны исследуемых анионов <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BD%D0%B8%D0%BE%D0%BD>. Эти вспомогательные зоны называются спейсерами - разделителями, функции которых выполняют амфолиты-носители, используемые в методе ИЭФ <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%B7%D0%BE%D1%8D%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%B5_%D1%84%D0%BE%D0%BA%D1%83%D1%81%D0%B8%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D0%B5>. особенностью метода ИТФ является то, что процесс сопровождается концентрированием зон, эффект от которого приводит к разрешению, сравнимому и даже превосходящему разделение методом ИЭФ <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%B7%D0%BE%D1%8D%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%B5_%D1%84%D0%BE%D0%BA%D1%83%D1%81%D0%B8%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D0%B5>. Результаты разделения смесей методом ИТФ фиксируются на ленте самописца в виде графика измерения трех параметров:
|
|
|
· интегральная кривая тепловыделения: по этой кривой можно определить разницу температур <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A2%D0%B5%D0%BC%D0%BF%D0%B5%D1%80%D0%B0%D1%82%D1%83%D1%80%D0%B0> между соседними зонами, что служит мерой градиента <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%93%D1%80%D0%B0%D0%B4%D0%B8%D0%B5%D0%BD%D1%82> напряженности <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9D%D0%B0%D0%BF%D1%80%D1%8F%D0%B6%D0%B5%D0%BD%D0%BD%D0%BE%D1%81%D1%82%D1%8C> поля <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%B5_%D0%BF%D0%BE%D0%BB%D0%B5>, то есть разницы электрофоретических <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%BE%D1%84%D0%BE%D1%80%D0%B5%D0%B7> подвижностью двух ионов <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%BE%D0%BD>
· дифференциальная кривая тепловыделения: длина отрезков этой кривой соответствуют ширине зоны вещества, а также служит мерой абсолютного количества вещества в пробе
· кривая поглощения в УФ-свете: длина отрезков этой кривой соответствует значению экстинкции <http://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%AD%D0%BA%D1%81%D1%82%D0%B8%D0%BD%D0%BA%D1%86%D0%B8%D1%8F&action=edit&redlink=1> вещества. Зная коэффициент молярной экстинкции <http://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%9A%D0%BE%D1%8D%D1%84%D1%84%D0%B8%D1%86%D0%B8%D0%B5%D0%BD%D1%82_%D0%BC%D0%BE%D0%BB%D1%8F%D1%80%D0%BD%D0%BE%D0%B9_%D1%8D%D0%BA%D1%81%D1%82%D0%B8%D0%BD%D0%BA%D1%86%D0%B8%D0%B8&action=edit&redlink=1> вещества, можно определить абсолютное содержание вещества в пробе, а также вычислить его концентрацию <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D0%BE%D0%BD%D1%86%D0%B5%D0%BD%D1%82%D1%80%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F> в зоне.
Этапы разделения двух образцов при помощи изотахофореза: Белый цвет - ведущий электролит, серый - замыкающий электролит, заштрихованы - анализируемые образцы
Принцип изотахофореза
При «классическом» электрофорезе разделяемые ионы находятся в однородном электрофоретическом буфере и движутся в электрическом поле с разными скоростями. В условиях изотахофореза все ионы перемещаются с одной и той же скоростью, но располагаются друг за другом в соответствии с их подвижностями. Рассмотрим зоны, содержащие отрицательно заряженные ионы А и В с подвижностями тА~>тв" и общим противоионом Р. При наложении электрического поля ионы будут двигаться с одинаковой скоростью в последовательно расположенных зонах.
|
|
|
Уравнение вывел Роутс. Оно представляет собой расширенную форму регулирующей функции Кольрауша. Согласно этому уравнению, концентрация вещества В в зоне 2 определяется концентрацией вещества А в зоне 1.
Помимо баланса электрического тока, подробно описанного выше, существуют еще три других важных принципа, которые необходимо иметь в виду.
Баланс масс. Концентрация противоионов в зоне должна оставаться постоянной после достижения состояния равновесия, т. е. необходимо, чтобы количества противоионов, входящих в зону и покидающих ее, были равны между собой.
Электронейтральность. Число положительно и отрицательно заряженных ионов в данной зоне одинаково.
Химическое равновесие. Содержание диссоциированных и недисооциированных молекул определяется константами кислотно-щелочного равновесия.
При изотахофорезе разделение ионов происходит в соответствии с их подвижностями, а концентрация ионов в каждой зоне зависит от концентрации предшествующего иона. Это означает, что концентрация ионов в любой зоне определяется первым, или ведущим, ионом. Необходимо, чтобы исследуемый ион находился между ведущим и замыкающим ионами. Последний должен обладать самой низкой подвижностью по сравнению со всеми находящимися в системе ионами. В этом случае ионы располагаются в такой последовательности, что ион с более высокой подвижностью будет двигаться впереди иона с меньшей подвижностью. Поскольку в условиях изотахофореза скорости всех ионов, как и сила тока во всех зонах, одинаковы, согласно закону Ома, градиент напряжения в каждой зоне будет. Чем меньше подвижность иона, тем больше перепад напряжения в этой зоне. Поэтому все ионы приобретают одинаковую скорость, несмотря на различия в их подвижностях.
|
|
|
Как уже отмечалось, концентрации ионов в зонах не могут отличаться от той, которая задана концентрацией ведущего иона и подвижностями ведущего и исследуемого ионов. Если же концентрация какого-либо иона, содержащегося в пробе, не подчиняется этому правилу, вытекающему из регулирующей функции Кольрауша, то он непременно подвергнется разведению или сконцентрируется до предписанного уровня. Вследствие этого изотахофореграмма отличается от всех других видов фореграмм и хроматограмм. На ней высота ступенек, образуемых сигналами, является характеристикой каждого вида иона, а расстояние между сигналами дает информацию о числе ионов.
При изотахофорезе наряду с эффектом концентрирования наблюдается также явление автоматического повышения резкости границ между зонами. Рассмотрим состояние равновесия, при котором все ионы движутся с одинаковой скоростью, и предположим, что ион О диффундировал в зону где градиент напряжения ниже, чем в зоне А. При более низком градиенте напряжения скорость иона снизится и он не сможет двигаться наравне с другими ионами в зоне N. Поэтому он отстанет и снова попадет в свою зону. Если же ион О диффундирует, наоборот, в зону R с более высоким градиентом напряжения, то приобретет там более высокую скорость, благодаря которой этот ион опять-таки вернется в свою зону.
Для разделения с помощью изотахофореза двух ионов необходимо, чтобы их подвижности различались по крайней мере на 10%. Подвижность иона зависит от нескольких параметров, например сольватации, вязкости растворителя, диэлектрической постоянной, наконец, радиуса и заряда иона. Ее можно изменять, варьируя растворители или рН, определяющий соотношение между диссоциированными и недиосоциированными молекулами. Так, ионы К+ и NH+4 имеют в воде почти одинаковую подвижность, между тем они очень хорошо разделяются в метаноле. Подвижность белков сильно зависит от рН, поэтому рН играет решающую роль при изотахофорезе белков. Все зоны имеют разные величины рН. В анионной системе величина рН обычно возрастает в направлении от ведущего иона к замыкающему. При экстремальных значениях рН (ниже рН=3 и выше рН=10) условия изотахофореза нарушаются, так как ионы Н+ и ОН сами обеспечивают проводимость. Присутствие карбоната при высоких рН также оказывает неблагоприятное действие. Если в анионной системе величина рН более чем на одну единицу ниже (а в катионной системе выше), чем величины рК соответствующих видов ионов, то эффективная подвижность окажется настолько низкой, что возникает потребность в очень высоком градиенте напряжения, который невозможно обеспечить доступными источниками питания. Степень варьирования рН ограничена также буферной емкостью противоиона.
|
|
|
