 |
В лекарствах и биосубстратах
|
|
|
|
Определение содержания антимикробных препаратов в лекарственных формах и субстанциях, равно как и определение их концентраций в биологических жидкостях и тканях (т.е. изучение фармакокинетики противомикробных веществ) представляют собой две методически сходных ветви аналитической микробиологии. Широкий круг микробиологов мало знаком с ними, хотя их значимость для терапии огромна: в первом случае оценивается качество лекарства, во втором – эффективность и безопасность его дозы.
Микробиологический метод определения содержания антимикробного лекарственного соединения в любом объекте не является единственным. Но только он прост в исполнении, дешев, не требует специального оборудования, а главное –– именно микробиологический метод позволяет определить присутствие активной молекулы препарата (а не его фрагмента или метаболита). По мере увеличения роли клинического микробиолога в лечебном процессе необходимость проведения соответствующих исследований будет возрастать.
Метод основан на диффузии антимикробного вещества в засеянную питательную среду из определенного резервуара (лунки, полого цилиндра), вокруг которого после инкубации образуется зона подавления роста. Если процесс зонообразования идет параллельно при диффузии в гель вещества известной (контрольной) концентрации и из изучаемого образца, то сравнение размеров зон подавления роста в том и другом случае с помощью специального метода обсчета позволяет определить содержание антибиотика в анализируемом объекте.
Образование зоны подавления роста тест-микроба процесс сложный, зависящий от ряда факторов: диффузионной способности антимикробного соединения, его стабильности в питательной среде, наличия сопутствующих веществ, роста культуры, ее чувствительности к антимикробному препарату и мн.др. Совершенно очевидно, что решающим компонентом анализа является питательная среда, ее характеристики и качество. Именно она обеспечивает и образование «газона», и диффузию антибиотика в гель. Только при наличии своего рода баланса между тем и другим достигается информативность образующихся зон подавления роста микроба.
|
|
|
Универсальной среды для определения концентрации антимикробных соединений не существует (как и нет единой тест-культуры). Для каждой группы антибиотиков предложена своя питательная среда или несколько сред (последнее чаще).
Питательные среды подобного назначения должны быть просты по составу, поскольку любые дополнительные компоненты могут препятствовать диффузии антимикробного препарата в гель. рН среды должен быть строго выверен; этот показатель является очень важным элементом качественного проведения анализа.
Микробиолог, определяющий концентрацию антибиотика в каком-либо субстрате, может столкнуться с парадоксальным фактом: смена серии агара, мясного или других малостандартизуемых компонентов питательной среды приводит к полному или частичному прекращению зонообразования. В других случаях зоны становятся не только малыми (по величине диаметра), но не четкими, трудночитаемыми или двойными, террасовидными. Поэтому при внутрилабораторном изготовлении питательной среды целесообразно пользоваться одними и теми же сериями элементов рецептуры. В противном случае не исключено, что средовар вынужден будет «перебирать» компоненты среды, пока конечный продукт (питательная среда) не обеспечит образование четких, достаточного размера зон подавления роста тест-микроба. Когда это возможно, приготовлением питательной среды для определения концентрации антибиотических веществ должны заниматься специалисты, имеющие соответствующий опыт и работающие вместе с микробиологами-аналитиками, способными обеспечить надлежащий контроль подобных питательных сред. Это тоже достаточно сложный вопрос.
|
|
|
По существующим формальным требованиям состав питательных сред, используемых при контроле лекарств, должен строго соответствовать Государственной фармакопее XI издания, вып.2. Приведем некоторые из них.
Среда для определения бензилпенициллина, ампициллина, оксациллина. Тест-микроб Staphylococcus aureus 209 Р.
Гидролизат мяса по Хоттингеру
(130 – 140 мг% аминного азота) 1000 мл
Глюкоза 1,0 г
Динатрия гидрофосфат 3,0 г
Агар-агар 10,0 – 12,0 г
рН 6,8 – 7,0
Несколько замечаний как к данной прописи, так и тем, что приведены ниже. В ГФ XI, вып.2 в качестве основного источника азота назван ферментативный гидролизат биомассы микроорганизмов без оболочек (5 г/л). Здесь и далее он не упоминается, поскольку широкого применения в настоящее время он не имеет. Вместо него приведен жидкий мясной гидролизат с определенной характеристикой по аминному азоту. Взамен жидкого гидролизата мяса по Хоттингеру можно использовать выпускаемый сухой продукт. Для получения необходимого количественного показателя аминного азота на литр требуется 13 – 18 г сухого гидролизата. Следует также обратить внимание на то, что глюкозу необходимо вводить в среду непосредственно перед ее использованием.
Среда для определения цефалексина и цефалотина имеет ту же пропись, но она используется с другой тест-культурой: Bacillus subtilis ATCC 6633.
Среда для эритромицина и олеандомицина; тест-микроб Bacillus cerеus var.mycoides HB.
Гидролизат маса по Хоттингеру
(30 – 35 мг% аминного азота) 1000 мл
Динатрия гидрофосфат 3,0 г
Агар-агар 15,0 г
рН 7,8 – 8,0
Жидкий гидролизат мяса по Хоттингеру может быть приготовлен, используя 3,5 – 5,0 г на литр гидролизата мяса, выпускаемого промышленностью. Хотя по ГФ XI приведенная выше среда не предусмотрена для исследования других макролидов, она была успешно использована авторами при изучении фармакокинетики кларитромицина и азитромицина.
Среда для изучения антибиотиков тетрациклиновой группы.
Тест-культура Bacillus subtilis var. Л2
|
|
|
Гидролизат мяса по Хоттингеру
(30 – 35 мг% аминого азота) 1000 мл
Глюкоза 10,0 г
Агар-агар 10,0 – 15,0 г
рН 6,8 – 7,0
Данная среда пригодна для исследования тетрациклина, доксициклина, окситетрациклина, метациклина.
Глюкоза добавляется в расплавленную среду непосредственно перед приготовлением чашек.
Среда для работы с гентамицином и стрептомицином. Тест-культуры рекомендуемые ГФ XI различны: для гентамицина Bacillus pumilis NCTC 8241, для стрептомицина Bacillus cereus var.mycoides 537. Пропись среды для гентамицина.
Гидролизат мяса по Хоттингеру
(30 – 35 мг% аминного азота) 1000 мл
Динатрия гидрофосфат 3,0 г
Агар-агар 15,0 г
рН 7,8 – 8,0
Среда для канамицина отличается от предшествующей более насыщенным гидролизатом Хоттингера (130 – 140 мг% аминного азота), меньшим количеством агар-агара –– 10,0 – 12,0 г. Тест-культура та же, что для анализа гентамицина. Имеется опыт применения этой же среды со спорами Bacillus subtilis АТСС 6633, причем исследователи считают, что зоны с этой культурой более четко очерчены.
Среда для работы с противогрибными препаратами: амфотерицином В, нистатином, леворином. Она же была (вне ГФ XI) использована при изучении фармакокинетики некоторых имидазольных производных. В прописи этой среды отсутствуют нестандартизируемые компоненты. Она первая успешная попытка создания «синтетической» среды с помощью солей, официально внедренная в практику. Однако малостандартизуемый агар-агар оставлен как желирующий компонент. В качестве основного источника азота использована аммонийная соль. Тест-культура Candida utilis ЛИА-01. Дано на литр.
Аммония цитрат, двузамещенный 5,0 г
Калия хлорид 20,0 г
Натрия хлорид 20,0 г
Динатрия гидрофосфат 5,0 г
Глюкоза 10,0 г
Агар-агар 18,0 г
рН 5,8 – 6,0
Количество глюкозы может быть уменьшено в зависимости от интенсивности роста тест-культуры. При изучении фармакокинетики необходимо проверить возможность зонообразования в результате действия нативной крови (бактерицидность крови). Подобный эффект вероятен при использовании «голодных» сред. Поэтому проверка антимикробного действия неразведенной крови до введения больному лекарства может быть весьма информативна и полезна. Кровь, взятая в разведении, подобным действием не обладает.
|
|
|
В фармакопею вошла еще одна «синтетическая» среда для определения концентрации антибиотика гелиомицина. В ней использован хлорид аммония. Опубликованы прописи «синтетических» сред для работы с аминогликозидами, тетрациклинами, макролидами, в которых источником азота также являются различные соли аммония.
В мировой практике существует значительное число питательных сред, используемых при исследовании содержания антибиотиков в лекарствах и субстратах различной природы, включая пищевые продукты. Для определения концентраций бензилпенициллина и бацитрацина предложена т.н. «среда № 2» следующего состава:
Панкреатический перевар желатина 6,0 г
Дрожжевой экстракт 3,0 г
Мясной экстракт 1,5 г
Агар-агар 15,0 г
рН 6,6 ± 0,1
Для исследования стрептомицина и других аминогликозидов используется «среда №5».
Агар-агар 15,0 г
Панкреатический перевар желатина 6,0 г
Дрожжевой экстракт 3,0 г
Мясной экстракт 1,5 г
рН 7,9 ± 0,1
Для работы с карбенициллином и полимиксином рекомендована следующая пропись среды (на литр).
Панкреатический перевар казеина 17,0 г
Натрия хлорид 5,0 г
Папаиновый перевар соевой муки 3,0 г
Дикалия гидрофосфат 2,5 г
Глюкоза 2,5 г
Агар-агар 20,0 г
рН 7,2 ± 0,1
Противогрибные препараты предложено исследовать на «среде № 21».
Глюкоза 11,0 г
Панкреатический перевар желатина 5,0 г
Дикалия гидрофосфат 3,68 г
Калия дигидрофосфат 1,32 г
Натрия хлорид 3,5 г
Дрожжевой экстракт 1,5 г
Мясной экстракт 1,5 г
Агар-агар 15,0 г
рН 6,6 ± 0,2
Перечень прописей может быть продолжен. Однако очевиден принцип конструирования подобных питательных сред, уже упомянутый выше: они должны обеспечить рост тест-культур (в этом отношении все приведенные рецептуры безупречны) и диффузию антибиотика в гель. Последнее зависимо от качества отдельных компонентов среды, в каждом случае она требует проверки и, достаточно часто, корректировки состава, количественной и качественной.
|
|
|
